李勝利 武坤毅 任曉勇

1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院科研中心實(shí)驗(yàn)室（西安710004）

2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（西安710004）

老年性聾亦稱(chēng)年齡相關(guān)性聽(tīng)力損失(age-related hearing loss AHL)，是以聽(tīng)覺(jué)器官退行性改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)，老年性聾的顯著特點(diǎn)是漸進(jìn)性和高頻聽(tīng)力損失。遺傳和環(huán)境因素是導(dǎo)致老年性聾發(fā)生的主要原因[1,2]。隨著老齡社會(huì)的到來(lái)，老年性耳聾問(wèn)題逐漸突出，成為一個(gè)重要的社會(huì)問(wèn)題[2，3]，不僅給老年人的生活和社交活動(dòng)造成很大的困難，而且可嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[3,4]。目前，老年性聾的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，預(yù)防和治療方面的策略更是嚴(yán)重缺乏[1,5-8]。

哺乳類(lèi)耳蝸外毛細(xì)胞（outer hair cell，OHC)呈長(zhǎng)圓柱形，在聲機(jī)械刺激下沿其長(zhǎng)軸具有伸長(zhǎng)和縮短的勁度改變響應(yīng)。1985年Brownell等[9]報(bào)告了耳蝸OHC受到電刺激時(shí)，細(xì)胞膜電位的變化會(huì)引起胞體的伸縮運(yùn)動(dòng)，且運(yùn)動(dòng)反應(yīng)具有頻率依賴(lài)性，稱(chēng)之為耳蝸OHC電運(yùn)動(dòng)。Zheng等（2000）[10]成功克隆了第一個(gè)OHC運(yùn)動(dòng)蛋白基因，命名為prestin[10，11]，它是OHC電致運(yùn)動(dòng)和耳蝸放大所必需的[12]。Prestin(SLC26A5)是一種膜蛋白，它獨(dú)特的分布和表達(dá)在內(nèi)耳的OHCs上。它定位在OHC細(xì)胞膜的側(cè)膜上，被認(rèn)為是一種擔(dān)負(fù)著OHC電致運(yùn)動(dòng)和提高聽(tīng)覺(jué)敏感性及頻率選擇性的物質(zhì)基礎(chǔ)[10,11,13，14]。然而，Prestin在不同的環(huán)境情況下均具有敏感的改變，諸如在耳毒性藥物的使用、噪聲暴露及特殊的生物分子反應(yīng)[15-19]。噪聲暴露后有顯著的prestin基因表達(dá)上調(diào)，使耳蝸對(duì)聲音的放大效應(yīng)消失[20]，同樣噪聲暴露可以使耳蝸prestin mRNA表達(dá)上調(diào)[21]。而水楊酸長(zhǎng)期應(yīng)用使耳蝸Prestin表達(dá)上調(diào)[22-24]。有研究已證明氨基糖甙類(lèi)抗生素使prestin mRNA表達(dá)下調(diào)發(fā)生在毛細(xì)胞凋亡之前[25]。

但在老年性聾方面，在耳蝸OHC的prestin表達(dá)方面有一些研究，但分歧較大，Rüttiger等[26]在F344小鼠和gerbils鼠發(fā)現(xiàn)耳蝸毛細(xì)胞在老年性聾時(shí)prestin蛋白表達(dá)沒(méi)有改變；Chen等(2009)[27]研究報(bào)道老年性聾Fischer 344/NHsd小鼠的毛細(xì)胞prestin表達(dá)下降;Chiemi（2010）[28]同樣用 F344/NHsd小鼠，免疫組化顯示耳蝸prestin表達(dá)增強(qiáng)。我們反復(fù)研究觀察顯示老年性聾小鼠耳蝸外毛細(xì)胞prestin的表達(dá)是下降的，說(shuō)明prestin參與老年性聾的過(guò)程，可能是早期老年性聾的分子機(jī)制之一。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物DBA/2J近交系小鼠來(lái)源于南京模式動(dòng)物研究所，品系編號(hào)；J000671，動(dòng)物選用4周（W）、8周(W)、16周(W)和32周(W)小鼠，每組12只，共使用48只小鼠。

1.2 聽(tīng)功能測(cè)定方法

動(dòng)物用0.75%戊巴比妥鈉（0.1mg/kg）麻醉后，用美國(guó)Inteligent Hearing Smart聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位儀測(cè)定聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)點(diǎn)位（ABR）。用針電極插入顱頂為記錄電極，兩側(cè)耳垂皮下為參考電極，鼻尖為接地電極。Click聲刺激，刺激率19.1/ms,高通300，低通3000，平均疊加512次，具體方法參照我們以前的方法（Li等，2008）[29]。

1.3 耳蝸鋪片及觀察方法

各組動(dòng)物測(cè)定ABR后，在麻醉狀態(tài)下，快速斷頭，迅速取出聽(tīng)泡，分離出耳蝸，在解剖顯微鏡下（OLYMPUS,TOKYO,297261），用纖細(xì)鋼針在耳蝸尖頂鉆一小孔，將前庭膜挑破，再挑破圓窗膜和卵圓窗膜，并在耳蝸底回骨隆起出，鉆一小孔，看到外淋巴液溢出。馬上用細(xì)的滴管吸取0.5%的硝酸銀溶液，從蝸尖的小孔和兩窗反復(fù)灌入。用雙蒸餾水洗滌數(shù)次，再灌入10%的福爾馬林固定液。在日光下曝光2-4小時(shí)。在解剖顯微鏡下分離鋪片。逐回將基底膜按次序放置在載玻片的甘油中，辨識(shí)正反面無(wú)誤后，加蓋蓋玻片，供光鏡觀察和進(jìn)行毛細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)

在光鏡下(Nikon DS-fi1)，耳蝸放大40倍，從耳蝸?lái)敾亻_(kāi)始逐個(gè)視野連續(xù)計(jì)數(shù)內(nèi)外毛細(xì)胞存在和消失的數(shù)目，外毛細(xì)胞分排記錄。存在毛細(xì)胞的主要標(biāo)志是毛細(xì)胞靜纖毛完整，內(nèi)毛細(xì)胞呈眉形，外毛細(xì)胞呈“V”字形，深染或淡染，但“V”字形完整的均視為正常存活的毛細(xì)胞；消失的毛細(xì)胞處“V”字形或眉字形消失，由支持細(xì)胞上皮填充，連續(xù)多個(gè)毛細(xì)胞消失處，由上排或下排存在的毛細(xì)胞估算出其消失數(shù)。計(jì)數(shù)完后，將三排外毛細(xì)胞的存在數(shù)與消失數(shù)由耳蝸?lái)敳康交撞恐饌€(gè)視野相加，計(jì)算出毛細(xì)胞損害的百分?jǐn)?shù)。將同一組的多個(gè)耳蝸在同部位的數(shù)字統(tǒng)計(jì)，制做出耳蝸全基底膜的毛細(xì)胞損害的耳蝸圖。

1.5 全耳蝸鋪片prestin抗體染色

動(dòng)物麻醉后，快速斷頭，分離出小鼠耳蝸，在體視顯微鏡下用纖細(xì)鋼針在耳蝸?lái)敾劂@一小孔，沿基底膜挑破前庭膜，同時(shí)挑破圓窗膜和卵圓窗膜，將4%多聚甲醛滴注入耳蝸內(nèi)。將標(biāo)本浸入在4%多聚甲醛中4℃固定4h，將耳蝸置入裝有PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下分離出耳蝸基底膜。將分離出的耳蝸基底膜在PBS溶液中漂洗3次(5min/次)。0.5%Triton 1h,將清洗后的基底膜標(biāo)本加入10%正常羊血清Blocker封閉30min，再用PBS溶液漂洗3次(5min/次)。將清洗后的基底膜標(biāo)本加入配好的一抗anti-prestin(1:500,3%羊血清溶液稀釋)放入37℃溫箱中過(guò)夜，次日取出標(biāo)本用PBS溶液漂洗3次(5min/次)。將清洗后的基底膜標(biāo)本加入二抗（1:200，PBS溶液稀釋?zhuān)?biāo)記Alexa Fluor-488山羊抗兔抗體（1:100，PBS溶液稀釋?zhuān)覝叵?h；然后在PBS溶液漂洗3次(5min/次)。滴有DAPI核染液30min后的最后將標(biāo)本平鋪載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡觀察(Leica TCS SP8)，用Image J軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.6 耳蝸基底膜全蛋白提取和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting)

過(guò)量0.75%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，迅速斷頭取出骨迷路，在干冰預(yù)冷的0.1 mol/LPBS中剝離耳蝸，取出基底膜組織，并在裂解液RIPA中粉碎，冰浴中多次劇烈振蕩使組織充分裂解，離心后收集上清液。按照BCA試劑盒說(shuō)明，用酶標(biāo)儀測(cè)量蛋白溶液濃度，以每孔20 μg的上樣量行SDS-PAGE凝膠電泳，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)移至規(guī)格為0.45 μm孔徑的PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1h后，用適當(dāng)稀釋的抗鼠β-actin抗體、羊抗小鼠SPAG6抗體或兔抗小鼠prestin抗體在3%奶粉TBST溶液中過(guò)夜孵育(4℃，≥8 h)。用PBS洗滌PVDF膜3×10 min/次，用相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗室溫下水平緩慢搖動(dòng)孵育1～2 h，用PBS洗滌3×10 min/次，加入發(fā)光底物，在暗室內(nèi)進(jìn)行醫(yī)用膠片的曝光并采集膠片圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism軟件，比較組與組之間單個(gè)點(diǎn)的差別采用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney檢驗(yàn)，比較兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組在一個(gè)或一個(gè)以上變量下多個(gè)點(diǎn)（不同時(shí)間）之間的差別使用ANOVA。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次或以上，非變量數(shù)據(jù)使用Mann-Whitney檢驗(yàn)分析，多變量使用方差（ANOVA）分析，應(yīng)用Graph-Pad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR反應(yīng)閾值的改變

4W與8W齡DBA/2J小鼠的ABR反應(yīng)閾值基本在30到40dBSPL之間，只是8W齡DBA/2J小鼠的ABR反應(yīng)閾值均值較4W齡DBA/2J小鼠的ABR反應(yīng)閾值高，達(dá)到58至60dBSPL；到8W齡DBA/2J小鼠的ABR反應(yīng)閾值明顯提高，達(dá)到60到70 dBSPL之間；到16W齡DBA/2J小鼠的ABR反應(yīng)閾值明顯提高，達(dá)到70到80 dBSPL之間；而到32W時(shí)ABR反應(yīng)閾值均值在80到100dBSPL以上。而且頻率越高，ABR閾值升高更顯著。各周齡DBA/2J小鼠的ABR反應(yīng)閾值平均值比較見(jiàn)圖1A,隨年齡增長(zhǎng)，各組動(dòng)物的ABR各波的潛伏期延長(zhǎng)（見(jiàn)圖1B）。失，中回有80%的消失，頂回有30%的消失；DBA/2J老化小鼠到32W時(shí)，基底回OHCs已全部消失，中回也基本消失殆盡達(dá)99.5%，頂回的OHCs有80%左右消失。證明DBA/2J老化小鼠的耳蝸毛細(xì)胞從基底回到頂回快速的消失。各周齡耳蝸外毛細(xì)胞消失在耳蝸部位分布見(jiàn)圖2。

圖2 4W,8W,16W和32WDBA/2J小鼠耳蝸毛細(xì)胞從頂回到基底回消失計(jì)數(shù)。隨周齡增加，小鼠耳蝸毛細(xì)胞損害消失快速增加，毛細(xì)胞損害從基底回開(kāi)始，快速向頂回發(fā)展，到32周齡時(shí)，僅頂回有少量毛細(xì)胞存在，其余各回毛細(xì)胞已基本消失。Fig.2 Mean cochleograms obtained from the cochleae for 4,8,16 and 32 weeks age old of DBA/2J mice.The DBA/2J mice agr was increased that the OHCs missing was raising from base to apex of the cochlea.The OHCs losses were greater at base of 32 week mice and increased toward the apex,there was severer missing of the OHCs.

圖1 A.DBA/2J小鼠各周齡的ABR閾值分布，隨周齡增加，聽(tīng)力閾值明顯升高。Fig.1 A Representative ABRs threshold of DBA/2J at 4,8,16 and 32 weeks mice,the results shown are elevated by following age-related increse.

圖1 B.各周齡DBA/2J小鼠腦干聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)點(diǎn)位ABR各波潛伏期各組之間具有顯著差異（P＜0.05）。Fig.1 B The ABR latency was long at 8,16 and 32 weeks age of DBA/2J mice.There was significant difference was found between 16 and 32 weeks age old mice(P＜0.05).

2.2 耳蝸毛細(xì)胞的消失

耳蝸鋪片光鏡下行全耳蝸毛細(xì)胞記數(shù)，可見(jiàn)4周齡DBA/2J小鼠的耳蝸基底回有56.35%外毛細(xì)胞（OHC）消失,中回僅有個(gè)別消失，頂回有11.07%的OHC消失，外毛細(xì)胞消失是從耳蝸基底部的80%處開(kāi)始；到8W時(shí)，DBA/2J小鼠的耳蝸基底回有97.85%OHC消失,中回12.7%OHC消失，頂回近20%的OHC消失，外毛細(xì)胞消失是從耳蝸基底部的0%處開(kāi)始；而12W和16W的DBA/2J小鼠耳蝸毛細(xì)胞消失均從50%的耳蝸處開(kāi)始，說(shuō)明近乎一半的外毛細(xì)胞消失；16周齡時(shí)基底回OHCs完全消

2.3 prestin在耳蝸表達(dá)的改變

在4W時(shí)OHC prestin馬達(dá)蛋白的表達(dá)從基底回到頂回均有強(qiáng)列的表達(dá),基本上是OHC特異染色，而IHC染色較淡；正常OHC prestin免疫組化標(biāo)記細(xì)胞膜為亮綠色，呈圓環(huán)狀，OHC損害早期表現(xiàn)為prestin標(biāo)記的圓環(huán)狀變形或不規(guī)則形狀，OHC消失后prestin無(wú)標(biāo)記（圖3a,b,c）；到8W時(shí)耳蝸OHC prestin的表達(dá)整體下降，與4W時(shí)相比表達(dá)下降十分顯著（P≤0.01）；到16W時(shí)，耳蝸OHC prestin的表達(dá)下降更明顯（圖3B），圖象分析對(duì)熒光進(jìn)行光密度測(cè)量，可見(jiàn)隨增齡改變其耳蝸外毛細(xì)胞的prestin馬達(dá)蛋白的表達(dá)下降（圖3d）。與其相對(duì)應(yīng)的是ABR反應(yīng)閾值隨增齡顯著升高。

圖3a正常OHC prestin免疫組化標(biāo)記細(xì)胞膜為亮綠色，呈園環(huán)狀，OHC損害早期表現(xiàn)為prestin標(biāo)記的圓環(huán)狀變形或不規(guī)則形狀(星號(hào))，OHC消失后prestin無(wú)標(biāo)記（箭頭）（圖3A，B，C）；Fig.3a Immunofluorescent staining of DBA/2J mice OHCs for prestin in situ whole-mount preparation，three rows of OHCs consequently disappeared.A typical image of prestin immunoreactivity in the cochlear OHCs of 4 week old mice.The circular immunolabeling in the three rows of OHCs,indicated by the arrows is clearly visible.Green colors represent prestin labeling,respect.Prestin staining shows a ring-labeling pattern only in the OHCs area.In the 8 week age-old mice cochlea of OHCs shown have a few loss in apex turn,middle and basal turn there is a larger OHCs loss as arrow indicate,the surreal OHCs prestin expression was decrease at baes turn(B,C)（arrowheads）.

圖3b各周齡DBA/2J小鼠耳蝸毛細(xì)胞prestin表達(dá)情況。4周齡(week)（A-C）較 8周齡（week)（D-F）耳蝸外毛細(xì)胞（OHC）的prestin表達(dá)在耳蝸各回明顯強(qiáng)。Fig.3b Immunofluorescent staining of DBA/2J mice OHCs for prestin in situ whole-mount preparation，three rows of OHCs consequently disappeared.A typical image of prestin immunoreactivity in the cochlear OHCs of 4 week old mice.The circular immunolabeling in the three rows of OHCs,indicated by the arrows is clearly visible.OHC1,OHC2 and OHC3 indicate the first,second and third rows of OHCs.Green colors represent prestin labeling,respect.Prestin staining shows a ring-labeling pattern only in the OHCs area.An optical transversal section of confocal image of immunofluorescent staining of the cochlea was shown the 4 week age-old that three rows of OHCs is all present,not OHCs missing and the prestin staining strong from apex to basal turn(A-C).In the 8 week age-old mice cochlea of OHCs shown have a few loss in apex turn,middle and basal turn there is a larger OHCs loss as arrow indicate,the surreal OHCs prestin expression was decrease then 4 week age-old mice(D-F).

圖 3c 16周（Week)與32周（week）耳蝸毛細(xì)胞prestin免疫組化標(biāo)記顯示OHC表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱（A-F）。32周齡小鼠耳蝸OHC消失明顯增多（箭頭）,OHC prestin表達(dá)明顯減弱(D-F)。4周齡的對(duì)照組OHC prestin表達(dá)較強(qiáng)（G-I）.Fig.3c 16 and 32 weeks DBA/2J mice cochlea of OHCs prestin staining compare showned that 16 week age-old OHCs strong staining of prestin(A-B)then 32 week age-old,their OHCs prestin staining was more weeks(D-F)from apex to basal turn,32 week age-old mice of OHCs loss were more larger compared to 8 week-old mice.The control of 4 week group OHC shown the prestin expression more strong then 16 and 32 weeks mice(G-I).

圖3d Western blotting測(cè)定耳蝸基底膜prestin蛋白光密度值。Prestin表達(dá)的蛋白印跡在80KDa，參照物為β-actin(箭頭)，各周齡組DBA/2J小鼠耳蝸prestin蛋白表達(dá)印跡的光密度隨增齡而明顯下降（A）。定量分析各組動(dòng)物的耳蝸基底膜的prestin蛋白光密度值，可見(jiàn)隨增齡耳蝸外毛細(xì)胞prestin表達(dá)蛋白量逐漸下降，各組間具有顯著性差異(P＜0.05)（星號(hào)）(B)。Fig.3d The intensity of the cochlea for prestin was measured the protein dense by Western blotting.The arrowhead inducate monormer and dimer blot of prestin(80KDa,),the blot intensity was decresed form 4 weeks to 32 weeks age-old mice samplea(A).Quantitative analysis of prestin Western blots in 4,8,16 and 32 weeks groups,the blot intensity was decresed that there is a significantly different from 4 week mice(asterisk,P＜0.01).

3 討論

感音神經(jīng)性聾，包括噪聲、耳中毒性和老年性聾導(dǎo)致的耳蝸毛細(xì)胞及其神經(jīng)細(xì)胞損害的病理基礎(chǔ)主要是毛細(xì)胞凋亡[30-31]，而檢測(cè)細(xì)胞凋亡的分子技術(shù)方法包括TUNEL,Caspasis系列等主要觀察到毛細(xì)胞最終死亡的結(jié)果，對(duì)于耳聾的預(yù)防和治療研究而言，這些指標(biāo)顯而易見(jiàn)是錯(cuò)過(guò)了最佳時(shí)機(jī)。首先選擇一種或數(shù)種在耳蝸毛細(xì)胞凋亡前尚有可逆性恢復(fù)的檢測(cè)指標(biāo)，這種指標(biāo)最理想的是首先是耳蝸毛細(xì)胞所特有的，不僅在耳蝸能檢測(cè)到，而且在外周體液中亦能檢測(cè)得到；其次是聽(tīng)功能改變和這些指標(biāo)是密切關(guān)聯(lián)的。我們根據(jù)目前的研究現(xiàn)狀認(rèn)為Prestin可能具有這些特點(diǎn)。Parham(2015)[32]推測(cè)prestin可以作為感音神經(jīng)性聾早期檢測(cè)的生化標(biāo)志。Kourosh和Jonas（2016)[33]研究證明噪聲暴露后prestin血清濃度水平較對(duì)照組明顯下降。這些推測(cè)和初步實(shí)驗(yàn)支持我們的假設(shè)。有研究顯示prestin可能在早期就參與了氨基糖甙類(lèi)抗生素誘導(dǎo)的外毛細(xì)胞凋亡過(guò)程[17],卡那霉素下調(diào)prestin誘導(dǎo)毛細(xì)胞凋亡[25]。有實(shí)驗(yàn)表明，在外毛細(xì)胞的形態(tài)出現(xiàn)病變之前，prestin的mRNA水平已經(jīng)出現(xiàn)了顯著的下降，說(shuō)明卡那霉素誘導(dǎo)的Prestin表達(dá)變化出現(xiàn)在毛細(xì)胞形態(tài)改變之前。雖然趙寧等觀察到慶大霉素是誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞Prestin表達(dá)的上調(diào)[18]。盡管具體的機(jī)制還不清楚，從上述研究看prestin似乎傳導(dǎo)了凋亡啟動(dòng)信號(hào)，而這個(gè)過(guò)程很可能是由細(xì)胞間的刺激因素所引發(fā)的，比如氨基糖甙類(lèi)抗生素的耳毒性、噪聲或其它因素。這表明prestin具有重要的聽(tīng)覺(jué)生理功能的同時(shí)也可能具有參與致病過(guò)程中的多重特性。因此人們猜測(cè)，prestin表達(dá)的下調(diào)似乎發(fā)揮了兩種重要的功能：第一可能是預(yù)防或減少外毛細(xì)胞的凋亡；第二則可能類(lèi)似于預(yù)警作用，提示外部環(huán)境具有毒性而激發(fā)聽(tīng)力通路上那些敏感的部分盡早做出防御性的變化。一些研究表明prestin表達(dá)變化和耳蝸出現(xiàn)毛細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變之間存在一定的時(shí)間間隔，這或許提示了對(duì)于氨基糖甙類(lèi)藥物致聾的病人而言，可能存在一個(gè)適于進(jìn)行有效治療的時(shí)間范圍[18]。而我們把此種猜測(cè)提升為把prestin作為對(duì)耳聾早期診斷和預(yù)防治療的關(guān)鍵的生化指標(biāo)。

在老年性聾方面，耳蝸外毛細(xì)胞prestin表達(dá)的改變有幾個(gè)研究，但分歧較大，Ruttiger（2007)在F344小鼠和gerbils鼠發(fā)現(xiàn)耳蝸毛細(xì)胞在老年性聾時(shí)prestin蛋白表達(dá)沒(méi)有改變[26]，其研究缺乏蛋白定量分析；Chen等(2009)[27]研究報(bào)道老年性聾Fischer 344/NHsd大鼠的耳蝸毛細(xì)胞prestin表達(dá)下降，但方法不夠全面；Chiemi（2010）[28]同樣用F344/NHsd大鼠，免疫組化顯示prestin表達(dá)增強(qiáng)。這些研究沒(méi)有定量指標(biāo)，況且并不是專(zhuān)門(mén)進(jìn)行老年性聾的耳蝸毛細(xì)胞prestin表達(dá)的研究。我們的研究包括耳蝸形態(tài)免疫組化和蛋白定量Western Blot的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示老年性聾小鼠耳蝸外毛細(xì)胞prestin的表達(dá)是下降的（圖b,c,d），所使用的技術(shù)方法全面，觀察的動(dòng)物鼠齡分布廣，動(dòng)物數(shù)量多。研究結(jié)果充分說(shuō)明prestin參與老年性聾的病理過(guò)程，可能是早期老年性聾的分子機(jī)制之一。與上述Fischer 344/NHsd老年大鼠耳蝸prestin表達(dá)的差異可能與其研究方法及動(dòng)物種系的遺傳背景有關(guān)。而與噪聲性聾和耳毒性藥物致聾的結(jié)果截然相反，可能是老年性聾屬于自然衰老，聽(tīng)覺(jué)器官退變導(dǎo)致的耳蝸prestin表達(dá)下調(diào)，這種下調(diào)是一種生理性的改變，并非是噪聲性聾和耳毒性藥物致聾的損害應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致的耳蝸prestin表達(dá)上調(diào)，來(lái)補(bǔ)償耳蝸組織損傷造成的聽(tīng)力損害。這也提示我們?cè)谕瑯訛楦幸羯窠?jīng)耳聾的噪聲性聾、藥物中毒和老年性聾中，耳蝸prestin表達(dá)的差異，可能反映出治療方法是應(yīng)該區(qū)別對(duì)待，不可一概而論。

從早期的研究觀察可以發(fā)現(xiàn)prestin的改變是在毛細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞凋亡前出現(xiàn)，此時(shí)的細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)存在，并且尚具有一定的功能。我們認(rèn)為此時(shí)的干預(yù)治療是一個(gè)最佳時(shí)間窗口，但這需要進(jìn)行系列的研究方能確定。而選擇快速老化的老年性聾動(dòng)物模型是比較合適的。目前廣泛應(yīng)用的純種系小鼠作為人類(lèi)老年性聾或年齡相關(guān)聽(tīng)力損失(Age-related Hearing Loss,AHL)的重要模型的有C57BL/6J(B6)，DBA/2J(D2)和 BALB/cJ(C)。DBA/2J小鼠顯示非常早發(fā)和快速的漸進(jìn)性感音神經(jīng)性聾（Zheng 等，1999）[34]。Johnson等（2015）[35]已經(jīng)證明DBA/2J小鼠老年性聾基因定位在染色體18(ahl8)并顯示一個(gè)Fscn2基因的錯(cuò)義突變,12W DBA/2J小鼠有80dBSPL的ABR反應(yīng)閾值，雖然DBA/2J(D2)和C57BL/6J(B6)種系均有AHL-易感的Cdh23 等位基因 (Noben-Trauth 等，2003)[36]，而DBA/2J較C57BL/6J小鼠顯示更早和更快速的聽(tīng)力損失(Zheng等，1999)[34]。掃描電鏡分析顯示DBA/2J小鼠毛細(xì)胞靜纖毛異常和蛻變可能是造成快速聽(tīng)力損失 (Perrin等，2013;Shin等，2010)[37,38]。而Fscn2基因錯(cuò)義突變?cè)贒BA/2J小鼠是獨(dú)特的，是在ahl8-相關(guān)聽(tīng)力損失的基礎(chǔ)上的(Shin等，2010)[38]，。與之相比，F(xiàn)ischer 344/NHs大鼠的遺傳背景尚不清楚[39]，而且高頻聽(tīng)力損失到9-12個(gè)月才出現(xiàn)，耳蝸毛細(xì)胞損害主要是頂回及基底回的下部分，并且沒(méi)有內(nèi)毛細(xì)胞的損害消失（Bielefeld等,2008）[40]。我們的實(shí)驗(yàn)觀察證明DBA/2J小鼠在一月齡時(shí)出現(xiàn)聽(tīng)力損失，耳蝸毛細(xì)胞從基底部開(kāi)始出現(xiàn)損害消失，同時(shí)頂回亦有毛細(xì)胞消失（圖2），這點(diǎn)和Fischer344/NHs大鼠一致，但不同的是耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞與外毛細(xì)胞同時(shí)損害消失。而存留的外毛細(xì)胞Prestin表達(dá)較強(qiáng)，隨增齡發(fā)展，耳蝸毛細(xì)胞損害逐步增多，同時(shí)Prestin在存留毛細(xì)胞上的表達(dá)亦逐漸下降（圖3a,b,c）。聽(tīng)力學(xué)測(cè)定亦同樣證明DBA/2J小鼠的ABR反應(yīng)閾值亦逐步升高，與耳蝸病理形態(tài)的改變是一致的(圖1A,B）。這些特點(diǎn)表明DBA/2J小鼠是觀察prestin表達(dá)改變理想的動(dòng)物模型。

我們采用DBA/2J小鼠為老年性聾動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)4周齡(W)小鼠開(kāi)始出現(xiàn)輕度聽(tīng)力下降和少量毛細(xì)胞損失；到8周齡時(shí)已經(jīng)達(dá)到中度聽(tīng)力損失；到16周齡時(shí)已經(jīng)達(dá)到重度聽(tīng)力損失，耳蝸毛細(xì)胞有一半損害消失；32周齡時(shí)聽(tīng)力已基本喪失殆盡（圖1），并且外毛細(xì)胞的損害是從耳蝸基底回開(kāi)始，隨增齡逐漸向耳蝸中回和頂回發(fā)展。利用這種快速老化聽(tīng)力下降的特點(diǎn)，我們進(jìn)行耳蝸毛細(xì)胞prestin馬達(dá)蛋白表達(dá)觀察，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4周齡時(shí)DBA/2J小鼠耳蝸各回的prestin表達(dá)較強(qiáng)，僅少量毛細(xì)胞消失；而到8周齡時(shí)prestin表達(dá)強(qiáng)度較4周齡時(shí)下降；到16和32周齡時(shí)prestin表達(dá)強(qiáng)度較前更低，同時(shí)毛細(xì)胞消失也更多見(jiàn)（圖3，b,c）。在觀察prestin表達(dá)與毛細(xì)胞核存在的關(guān)系上，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞核存在時(shí)的毛細(xì)胞同時(shí)亦表達(dá)prestin。說(shuō)明prestin在存活的毛細(xì)胞上表達(dá)，并且此時(shí)的聽(tīng)功能狀態(tài)與prestin在毛細(xì)胞的表達(dá)及表達(dá)強(qiáng)度的存在是一致的。老年性聾耳蝸prestin表達(dá)下降的機(jī)制可能是：⑴老化導(dǎo)致的細(xì)胞代謝紊亂(Wu等,2004)[41]，自由基蓄積、氧化應(yīng)激和線粒體的損傷，Someya等(2009)報(bào)告年齡相關(guān)聽(tīng)力損失（AHL）的主要機(jī)制是氧化應(yīng)激反應(yīng)歸因于Bak依賴(lài)的線粒體凋亡[42]。使毛細(xì)胞膜上的prestin蛋白合成障礙，從而導(dǎo)致毛細(xì)胞放大功能降低而影響聽(tīng)力；⑵老年性聾的耳蝸和中樞神經(jīng)均有病理改變，耳蝸的血管紋、螺旋神經(jīng)以及內(nèi)耳的離子平衡均有改變，這些組織細(xì)胞中的信號(hào)途徑異常導(dǎo)致prestin蛋白的表達(dá)失活，從而導(dǎo)致prestin在毛細(xì)胞中的表達(dá)下降；（3）老年性聾相關(guān)基因突變、缺失導(dǎo)致毛細(xì)胞損害凋亡，破壞了毛細(xì)胞膜的完整性，使prestin表達(dá)下降，從而導(dǎo)致聽(tīng)力喪失。這些研究說(shuō)明Prestin可以作為耳蝸早期病理改變的指標(biāo)。這對(duì)老年性聾的預(yù)防和治療可能具有重要的意義。進(jìn)一步的研究要明確毛細(xì)胞prestin的表達(dá)量變化與毛細(xì)胞存活或消失的直接關(guān)系，以及毛細(xì)胞prestin的表達(dá)量改變的何種指標(biāo)可以達(dá)到使毛細(xì)胞損害可以逆轉(zhuǎn)，進(jìn)一步探討人為操縱prestin表達(dá)上調(diào)是否可以治療老年性耳聾，可為耳聾的預(yù)防及治療提供更可靠的依據(jù)。