田霞 肖作奇 黃懿 潘濤 歐陽(yáng)波

[摘要] 目的 建立陰炎凈洗液的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析方法。 方法 依利特ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，柱溫為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇210 nm和280 nm。 結(jié)果 建立了陰炎凈的HPLC指紋圖譜，標(biāo)示出33個(gè)共有色譜峰，同時(shí)對(duì)其中5個(gè)色譜峰進(jìn)行歸屬。 結(jié)論 雙波長(zhǎng)指紋圖譜實(shí)現(xiàn)了較為全面的評(píng)價(jià)，建立的方法靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單，分離效果好，可作為陰炎凈洗液質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法。

[關(guān)鍵詞] 陰炎凈洗液；指紋圖譜；高效液相色譜；質(zhì)量控制

[中圖分類號(hào)] R284.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）08（a）-0027-05

[Abstract] Objective To establish fingerprint methods in Yinyanjing Lotion by high performance liquid chromatography （HPLC）. Methods A Hypersil ODS2 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used， the flow rate was 1.0 mL/min. The mobile phase was acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution with gradient elution at 25℃. The flow-rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 210 nm and 280 nm. Results The common modes for the HPLC fingerprints were set up by ensuring 33 common peaks in the chromatograms. 5 chemical constituents were analyzed qualitatively. Conclusion Dual-wavelength chromatographic fingerprint can realize the analysis of a formula as a whole. This method is sensitive， accurate and simple， and can be used for the quality control of Yinyanjing Lotion.

[Key words] Yinyanjing Lotion； Fingerprint； High performance liquid chromatography； Quality control

陰炎凈洗液是湖南省婦幼保健院臨床使用20余年的婦科洗液，由苦參、黃連、連翹、蛇床子等九味中藥組成，有殺菌、止癢等功效，臨床將其用于婦科陰道炎、宮頸炎等疾病的輔助治療[1]。處方中苦參所含的苦參堿和氧化苦參堿具有很好的抗菌、消炎作用[2-5]；黃連中小檗堿也是公認(rèn)的抑菌有效成分[6-7]；連翹苷是消炎的主要有效成分[8-9]；蛇床子素有祛濕殺蟲的療效[10-11]。這些化學(xué)成分是陰炎凈常用的質(zhì)量控制指標(biāo)，前期研究中，本研究?jī)H對(duì)其中一個(gè)或兩個(gè)成分含量進(jìn)行控制[12-14]，但中藥復(fù)方成分復(fù)雜，一個(gè)或兩個(gè)成分的測(cè)定不能反映該方的整體藥效，指紋圖譜技術(shù)是對(duì)該方的全成分進(jìn)行測(cè)定，可提高對(duì)該方質(zhì)量的控制。

文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，方中苦參堿和氧化苦參堿僅在低于230 nm波長(zhǎng)處有吸收值，而低波長(zhǎng)范圍內(nèi)高效液相色譜（HPLC）圖的基線容易漂移，所以單波長(zhǎng)難以實(shí)現(xiàn)對(duì)方中的成分進(jìn)行全面測(cè)定和評(píng)價(jià)。參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[15-20]，本研究選用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）進(jìn)行檢測(cè)，選用兩個(gè)波長(zhǎng)融合后的指紋圖譜對(duì)陰炎凈洗液進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 儀器與材料

電子分析天平（德國(guó)，Mettler Toledo XS205型，精度0.1 mg）；電子天平（日本，X4205型）；0.22 μm微孔濾膜（美國(guó)，密理博）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)）；超聲清洗器（上?？茖?dǎo)，HS-2060）；高效液相色譜儀（日本島津公司，LC-20A型）；二極管陣列檢測(cè)器（島津，SPD-M20A）；柱溫箱（島津，CTO-10AS）；色譜柱（Hypersil ODS2，5 μm，4.6 mm×250 mm），乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。小檗堿對(duì)照品（110713-200911）、苦參堿對(duì)照品（110805-200306）、氧化苦參堿（110780-201007）、連翹苷（110821-201213）和蛇床子素對(duì)照品（0822-200204）均來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院。陰炎凈洗液（批號(hào)：141015、141016、141017、141018、141028、141029、141030、141104、141105、141106）由湖南省婦幼保健院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Hypersil ODS2色譜柱，流動(dòng)相A為乙腈，B為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。檢測(cè)波長(zhǎng)為200～400 nm，流動(dòng)相流速1.0 mL/min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液配制

分別精密稱取小檗堿、苦參堿、氧化苦參堿、蛇床子素和連翹苷適量，用甲醇分別配制成濃度為0.672、1.213、0.694、1.648、0.896 mg/mL的溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得對(duì)照品溶液。取各對(duì)照品溶液200 μL混合均勻，制得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取陰炎凈洗液20.0 mL，置100 mL容量瓶中，加入乙醇定容，搖勻，取中間層溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 精密度試驗(yàn)及參照峰的選擇

取供試品溶液（批號(hào)：141015），按“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定?？疾旄鞴灿蟹宓南鄬?duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果所有共有峰相對(duì)保留時(shí)間均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）≤1.96%，共有峰相對(duì)峰面積值均RSD≤1.92%，提示該方法精密度良好。30號(hào)峰峰面積最大，因此將其選為本研究的參照色譜峰。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，取同一批陰炎凈洗液（批號(hào)：141015）平行制備6次，按“2.1”項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間均RSD≤1.76%，峰面積值均RSD≤2.19%，提示方法重復(fù)性好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液（批號(hào)：141015），按“2.1”項(xiàng)下條件于0、2、4、6、12、24 h分別測(cè)定1次，共測(cè)6次，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積值，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間均RSD≤2.34%，峰面積值均RSD≤2.19%，提示供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 指紋圖譜的建立

分別取10批次不同批號(hào)的陰炎凈洗液，按“2.1”項(xiàng)下條件分別測(cè)定。從島津LC-solution工作站中分別導(dǎo)出10批次陰炎凈洗液在210 nm（圖1A）處和280 nm（圖1B）的色譜圖，再導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的操作規(guī)范軟件（版本2004A）中，分別導(dǎo)出色譜圖txt文件，0～30 min選擇210 nm數(shù)據(jù)，30～120 min選擇280 nm數(shù)據(jù)，將兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)數(shù)據(jù)合并得到每批次陰炎凈洗液雙波長(zhǎng)融合指紋圖譜（圖1C）。將10批次陰炎凈洗液雙波長(zhǎng)融合指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的操作規(guī)范軟件（版本2004A），進(jìn)行多點(diǎn)校正后，然后匹配生成對(duì)照指紋圖譜（圖2），共確定33個(gè)共有峰，每批次陰炎凈洗液與對(duì)照指紋圖譜比較相似度均>0.988（表2），批次之間差異>0.964。

2.8 與對(duì)照品對(duì)照確定峰歸屬

各對(duì)照品溶液和混合對(duì)照品溶液的分析結(jié)果見(jiàn)圖3?？鄥A和氧化苦參堿在280 nm的色譜圖中沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)，雙波長(zhǎng)融合后5中對(duì)照物質(zhì)的色譜峰均能得到有效的體現(xiàn)。結(jié)果表明，陰炎凈洗液色譜圖中的5號(hào)峰為苦參堿，6號(hào)峰為氧化苦參堿，25號(hào)峰為連翹苷，30號(hào)峰為小檗堿，32號(hào)峰為蛇床子素。

3 討論

本研究選用HPLC-DAD對(duì)陰炎凈洗液的全成分指紋圖譜進(jìn)行研究，研究結(jié)果表明，單波長(zhǎng)280 nm各成分之間分離較好，有較多成分能得到體現(xiàn)，但是方中的主要活性成分苦參堿和氧化苦參堿的色譜峰峰高很低，難以體現(xiàn)；在單波長(zhǎng)210 nm處，苦參堿和氧化苦參堿有較大的峰高值，其中9、10號(hào)峰也能較好地分離，但是30～60 min內(nèi)的成分分離較差，且100 min后有嚴(yán)重的信號(hào)漂移，蛇床子素的色譜峰得不到體現(xiàn)；綜合考慮選用雙波長(zhǎng)融合法對(duì)陰炎凈洗液的指紋圖譜進(jìn)行研究。

陰炎凈洗液的化學(xué)成分復(fù)雜，該方法得到了33個(gè)共有色譜峰。文獻(xiàn)檢索結(jié)果[2-11]表明，苦參堿、氧化苦參堿、連翹苷、小檗堿和蛇床子素等5種成分為該制劑主要抗菌、抗炎成分，由此，本研究對(duì)這5種成分對(duì)應(yīng)的色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)。該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等均符合要求，能全面地評(píng)價(jià)陰炎凈洗液的質(zhì)量。本研究尚處于初步階段，指紋圖譜與藥材和相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。

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