明超 曾云 熊敏

[摘要] 目的 觀察經(jīng)小腦延髓移植骨髓間充質干細胞（BMSCs）對受損脊髓白質的修復作用。 方法 改良Allen法構建大鼠脊髓損傷（SCI）模型，隨機分成模型組和BMSCs組。BMSCs組給予10 μL BMSCs懸液，模型組給予等量生理鹽水。BBB評分評估術后1、7、14、21、28 d神經(jīng)功能恢復情況，4.7 T核磁掃描儀研究大鼠脊髓白質變化；HE染色觀察SCI后的病理變化；熒光顯微鏡檢測Hoechst 33342標記的BMSCs數(shù)目。 結果 SCI術后7、14、21、28 d BMSCs組BBB評分均顯著高于模型組（P < 0.05），BMSCs組脊髓白質縱向彌散梯度接近于模型組（P > 0.05）。BMSCs組脊髓病灶中心平均面積明顯小于模型組（P < 0.05）。HE染色顯示BMSCs組14、28 d脊髓損傷的恢復情況明顯優(yōu)于模型組。BMSCs組術后7 d Hoechst 33342標記的細胞信號水平高于模型組，隨后從7 d到1個月逐漸降低，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。 結論 經(jīng)小腦延髓移植BMSCs對受損脊髓白質的恢復有著積極的促進作用，這為SCI的治療提供了一種新途徑。

[關鍵詞] 骨髓間充質干細胞；小腦延髓；脊髓損傷；脫髓鞘改變

[中圖分類號] R744 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（a）-0009-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of bone marrow stem cells （BMSCs） transplanted via cisterna magna on the rehabilitation of damaged spinal cord white matter. Methods The spinal cord injury （SCI） model was carried out by a modified Allen method， assigned into the control group and BMSCs group randomly. The BMSCs group and control group were given 10 μL BMSCs suspension and 10 μL physiological saline via cistern magna respectively. BBB scale was utilized to estimate the neurological recovery on 1， 7， 14， 21， 28 d postoperatively after SCI. The white matter changes in the injured spinal cord were tested using 4.7 T MRI scanner. HE staining was applied to access the rehabilitation condition. Flourescence microscope was performed to identify the signal level of Hoechst 33342 marked BMSCs in the injured spinal cord. Results The BBB scores in the BMSCs group were significantly higher than that of the control group on 7， 14， 21， 28 d after SCI （P < 0.05）. There was no statistically significant difference between the two groups regard to the longitudinal diffusion gradients of the damaged spinal cord white matter （P > 0.05）. The average size of the lesion center in the BMSCs group was significantly smaller than that of the control group （P < 0.05）. HE staining revealed that the recovery of the BMSCs group was better than the control group at 14， 28 d after SCI. The counts of Hoechst 33342 labelled cells were less in the control group than that in the BMSCs group at 7 d. Subsequently， they continued to decrease from 7 d to 4 weeks later， with highly statistically significant difference （P < 0.01）. Conclusion Bone marrow mesenchymal stem cells transplanted via cisterna magna has a positive role in promoting the rehabilitation of damaged spinal cord white matter， which is a novel way of treating SCI.

[Key words] Bone marrow stem cells； Cisterna magna； Spinal cord injury； Demyelinating changes

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的恢復是再生醫(yī)學中的一個亟待解決的問題。骨髓間充質干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）具有良好可塑性及分化成不同類型細胞的能力，占骨髓單核細胞總數(shù)的0.001%～0.01%，而且隨年齡增加而減少[1]。研究證實它們除了可以分化為骨骼、軟骨、脂肪及肌肉細胞等外，還能夠分化為神經(jīng)元類似細胞及心肌細胞，并且能夠分泌一系列保護因子如腦源性生長因子、神經(jīng)生長因子、膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等[2-3]。近年來，學者對BMSCs的特征、分離及分化的調(diào)控進行了大量研究。研究表明，BMSCs治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷時，能夠刺激肺巨噬細胞和脾臟調(diào)節(jié)性T細胞產(chǎn)生而發(fā)揮遠程“生物反應器”作用，進而促進循環(huán)系統(tǒng)中抗炎細胞因子的產(chǎn)生，并改善其微環(huán)境[4]，同時也可以與移植區(qū)域的細胞溝通，從而分泌保護因子，促進損傷恢復[5]。Tsumuraya等[6]發(fā)現(xiàn)，在小鼠脊髓橫斷損傷模型中，通過激活腦垂體腺嘌呤環(huán)化酶激活多肽基因，BMSCs可以通過降低促炎因子表達，同時促進抗炎因子表達從而抑制炎性反應，修復損傷組織。BMSCs移植治療SCI的途徑眾多，而經(jīng)小腦延髓移植卻少見報道，本實驗將探討經(jīng)小腦延髓途徑移植BMSCs到大鼠SCI部位后對受損脊髓白質的影響，從而為SCI的治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

SPF級雌性SD大鼠45只飼養(yǎng)于屏障環(huán)境內(nèi)[湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心，合格證號：SCXK（鄂）2016-0031]，40只（3月齡，250～300 g）采用隨機數(shù)表法分成模型組（n = 20）和BMSCs組（n = 20），5只（2～3周齡，45～65 g）用于獲取BMSCs。試劑：DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（美國GBICO公司）；兔抗大鼠CD34、小鼠抗大鼠CD90及CD105、驢抗小鼠FITC及PE、驢抗兔PE（英國abcam公司），HE染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 儀器

脊髓損傷打擊器（美國Keck神經(jīng)外科研究中心）、大鼠腦定位儀（美國Stoelting公司）、CO2細胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）、CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、XSP-63X熒光顯微鏡（日本Nikon公司）、FACS流式細胞儀（美國BD公司）、4.7 T核磁掃描儀（英國Resonance Instruments公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型構建 改良Allen法構建大鼠SCI模型[7]。術后分籠喂養(yǎng)，每日行人工排尿兩次，直至自主排尿功能恢復。

1.3.2 BMSCs分離培養(yǎng) 2～3周齡SD大鼠斷頸處死，取雙側股骨和脛骨，剪開骨髓腔，2%FBS-DMEM反復沖洗髓腔獲取單細胞懸液離心、棄上清，混勻后接種于T25培養(yǎng)瓶中。細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h沖洗去除未貼壁的造血細胞，每2～3天換液1次。待細胞融合至80%～90%時傳代。

1.3.3 BMSCs表型鑒定 第三代BMSCs胰酶消化后制成細胞懸液，分別加入兔抗大鼠CD34、小鼠抗大鼠CD90及CD105 1 μL（1∶50），混勻后4℃避光孵育1 h，PBS洗滌后加入驢抗小鼠FITC、驢抗兔、驢抗小鼠PE 1 μL（1∶50），混勻后室溫避光孵育20 min，離心后加入500 μL PBS，轉移至流式管上機。

1.3.4 BMSCs標記及移植 第三代對數(shù)期BMSCs移植前1 h加入Hoechst33342 20 μL標記，制成終濃度為3×107/mL的BMSCs懸液備用。細胞移植同文獻報道方法[8-9]。BMSCs組給予10 μL Hoechst 33342標記的細胞懸液（約3×107/mL），模型組給予等量生理鹽水。

1.3.5 大鼠神經(jīng)功能評估 參照BBB評分[10]評估大鼠后肢運動功能恢復情況。兩組大鼠分別在術后1、7、14、21、28 d取4只采用雙盲、二人獨立評分評估雙后肢恢復情況。

1.3.6 形態(tài)學評估 采用4.7 T核磁掃描儀掃描脊髓白質獲取矢狀面和軸向T2加權和彌散加權圖像，參數(shù)如下：回聲時間（TE=32 ms）、重復時間（TR=3 s）、視野（FOV=2.5 cm）、圖像大?。?28×128）、切片厚度（1.5 mm）。信號累積（NA=6）以提高信噪比，所有測量與大鼠呼吸節(jié)律一致從而消除運動偽影。

1.3.7 脊髓取材及HE染色 術后1、14、28 d于兩組隨機選取2只大鼠麻醉后經(jīng)升主動脈灌注4℃生理鹽水250 mL后改用4%多聚甲醛溶液250 mL。隨后取出T10脊髓組織固定后行HE染色。

1.3.8 BMSCs計數(shù) 大鼠灌注參照上文所述，脊髓取出后在冰凍切片機中制作T9～11連續(xù)橫切片（4 μm）。每只動物取10張片，熒光顯微鏡下記錄Hoechst 33342標記BMSCs數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs形態(tài)觀察及表面標志物鑒定

大鼠原代BMSCs培養(yǎng)24 h后逐漸貼壁，呈圓形，含較多雜細胞；48 h后細胞形態(tài)呈多樣化，形態(tài)不規(guī)則。7～10 d可見細胞呈現(xiàn)克隆式生長，融合成梭形或多角形，呈漩渦狀或放射狀排列。第三代BMSCs形態(tài)規(guī)整、排列整齊，呈長梭形。流式細胞儀鑒定BMSCs表面標志物陽性率分別為CD34 1.51%、CD90 98.9%、CD105 99.9%。見圖1～2。

2.2 脊髓損傷形態(tài)學改變

SCI術后7 d內(nèi)所有大鼠后肢運動、感覺功能喪失。術后1 d，中度損傷大鼠可見脊髓組織連續(xù)性中斷、表面變性壞死，損傷周圍區(qū)域亦有不同程度的變性壞死，假手術組大鼠脊髓完整，未見明顯出血壞死。見圖3。

2.3 BBB運動評分

SCI后第1天BMSCs組與模型組BBB運動評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。第7天開始，BMSCs組各個時間點BBB評分均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.4 SCI后HE染色形態(tài)變化

模型組術后1 d脊髓組織內(nèi)灰、白質界限不清，可見大量片狀出血，細胞數(shù)目減少，呈現(xiàn)一片“荒蕪”現(xiàn)象。術后14 d脊髓組織內(nèi)神經(jīng)纖維排列疏松、斷裂，神經(jīng)元細胞稀少，膠質細胞增生，可見空洞及瘢痕形成。術后28 d模型組灰質內(nèi)神經(jīng)元有所恢復，白質被瘢痕組織侵蝕、連接，瘢痕組織內(nèi)未見明顯的神經(jīng)纖維再生。BMSCs組術后1 d脊髓內(nèi)可見點、片狀出血，細胞腫脹、消失；術后14 d受損脊髓組織局部空洞，少量瘢痕組織形成，神經(jīng)細胞較多；術后28 d脊髓組織內(nèi)無明顯空洞及瘢痕組織形成，有大量神經(jīng)細胞分布于脊髓組織內(nèi)。見圖4。

2.5 核磁量化分析白質恢復情況

MRI結果顯示，BMSCs組脊髓白質未出現(xiàn)創(chuàng)傷后囊腫，而模型組可見明顯的創(chuàng)傷后脊髓空洞癥。術后28 d，脊髓白質彌散參數(shù)量化數(shù)據(jù)（表2）示，BMSCs組脊髓白質縱向彌散梯度接近于模型組，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），且這些結果接近于正常參考值。BMSCs組脊髓病灶中心平均面積明顯小于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

2.6 BMSCs遷移數(shù)目測定

熒光顯微鏡觀察示術后7 d BMSCs組損傷處Hoechst 33342陽性細胞數(shù)目顯著高于模型組（圖5），從第7天開始，BMSCs組脊髓損傷部位Hoechst 33342陽性細胞信號水平開始下降，由第7天的（968.5±321.7）個/mm2逐步下降至第1個月的（71.8±48.2）個/mm2，差異有統(tǒng)計學意義（t = 5.318，P < 0.01）。

3 討論

脊髓分灰質和白質，灰質主要由神經(jīng)細胞構成，白質主要由軸突組成。與其它研究不同，本研究關注細胞移植治療脊髓白質損傷的效果，而非神經(jīng)元。結果表明，經(jīng)小腦延髓移植BMSCs能促進SCI大鼠形態(tài)學恢復，并改善其運動功能。雖然熒光顯微鏡下證實BMSCs隨著損傷時間延長，數(shù)目減少，這可能與SCI后微環(huán)境惡劣有關，但不可否認的是大鼠運動功能有所恢復。研究表明，BMSCs保護SCI有兩種可能的機制：限制創(chuàng)傷性SCI的程度、促進細胞存活和軸突再生[11]。軸突脫髓鞘對神經(jīng)功能退化非常敏感，通過少突膠質細胞促進髓鞘再生對于限制軸突變性至關重要，而后者則會導致受損區(qū)域向周邊脊髓組織擴散[12-13]。最終，脊髓白質會嚴重受損，形成典型的創(chuàng)傷后囊腫，這在人類和實驗大鼠中都能觀察到。

BMSCs也可能通過影響細胞間聯(lián)系從而促進損傷修復以及刺激軸突生長。BMSCs分化除受細胞之間相互作用的影響，還受如損傷脊髓組織微環(huán)境的影響。因此，在復雜的SCI微環(huán)境中很難預測移植的BMSCs行為；但移植細胞向創(chuàng)傷區(qū)域遷移的能力決定了其向受損脊髓節(jié)段膠質瘢痕區(qū)域滲透的能力，這在修復缺失的神經(jīng)功能中起到至關重要的作用。研究表明，移植的BMSCs能夠滲透進入創(chuàng)傷后脊髓囊腫中，并能促進大鼠脊髓軸突再生[14]，這可能與囊腔內(nèi)的BMSCs分化為脊髓細胞群有關。

經(jīng)小腦延髓移植是經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注射移植治療SCI的方式之一。蛛網(wǎng)膜下腔移植途徑具有可多次注射、創(chuàng)傷小、不受血腦屏障限制、臨床可行性高等優(yōu)點[15]，在實踐中通常采用經(jīng)腰椎注射的方式。但在重力作用下，移植細胞大多停留在腰骶部，導致細胞移植效率降低。相比而言，經(jīng)小腦延髓移植具有更多優(yōu)勢。從腦脊液的生理循環(huán)來看，BMSCs在腦脊液循環(huán)及重力的雙重作用下可以最大程度到達SCI區(qū)域，從而改善移植細胞的存活、遷移、歸巢以及分化能力，促進脊髓白質再生[16-17]。研究證實BMSCs在促進SCI后神經(jīng)功能恢復中的作用與移植細胞分化成某種特定的細胞群體無關[18]。在體外條件下，BMSCs能夠顯著改善神經(jīng)傳導作用[18]。Xiong等[19]研究表明盡管移植的BMSCs只有部分分化為少突膠質細胞和星形膠質細胞，但行為學評分證實SCI大鼠后肢功能得到顯著改善。

綜上所述，經(jīng)小腦延髓移植BMSCs對受損脊髓白質的恢復有著積極的促進作用，是一種有效的途徑。但是這些細胞修復中樞神經(jīng)系統(tǒng)的確切機制尚有待于進一步研究。

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