向樂 余偉

[摘要] 目的 探討丹參注射液對大鼠下頜骨骨折愈合的影響，并通過測量骨形成蛋白-2（BMP-2）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）水平變化，探討丹參促進下頜骨骨折愈合的機制。 方法 選取SD大鼠48只，通過雙側(cè)下頜骨體部造成頰舌側(cè)貫穿不完全性骨折模型，按隨機數(shù)字表法分為實驗組和對照組，每組24只。實驗組每天腹腔注射丹參注射液（1 mL/kg），對照組每天腹腔注射生理鹽水。術(shù)后第1、2、3、4周，每組分別隨機處死6只大鼠，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清BMP-2、TGF-β1的含量。取出雙側(cè)下頜骨，右側(cè)下頜骨行X線片檢測骨折愈合情況并測量骨痂區(qū)的平均骨密度，標本經(jīng)組織脫鈣、石蠟包埋行HE染色后，采用骨組織形態(tài)計量學方法分析骨痂區(qū)骨小梁面積比、骨小梁寬度；左側(cè)下頜骨骨痂，行組織粉碎，采用RT-qPCR技術(shù)檢測BMP-2、TGF-β1的表達情況。 結(jié)果 X線結(jié)果顯示對照組骨折愈合明顯延遲于實驗組；從第2周開始，與對照組相比，實驗組骨痂骨密度明顯增加（P < 0.05或P < 0.01），骨痂區(qū)骨小梁面積比、骨小梁寬度顯著性增大（P < 0.05或P < 0.01）；差異隨著愈合時間的延長而顯著。ELISA結(jié)果顯示，術(shù)后實驗組血清BMP-2、TGF-β1的濃度均高于對照組（P < 0.05）。RT-qPCR結(jié)果顯示，術(shù)后第2周開始，實驗組骨痂中BMP-2及TGF-β1mRNA的表達均高于對照組（P < 0.01）。 結(jié)論 丹參注射液促進下頜骨骨折愈合，可能與促進骨折愈合過程中BMP-2、TGF-β1基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 丹參注射液；下頜骨骨折；骨形成蛋白-2；轉(zhuǎn)化生長因子-β1

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（a）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of Danshen Injection on mandibular fracture of healing in rat and observe the changes of bone morphogenetic protein-2（BMP-2）， transforming growth factor-β1（TGF-β1）. Methods Forty-eight SD rats were operated for incomplete fracture of hibateral mandible penetrated from buccal side to lingual side. The rats were divided into experimental group and control group according to random number table， with 24 rats in each group. The experiment group was administered with Danshen Injection by intraperitoneal injection， and the control group was administered with physiologic saline by intraperitoneal injection. The right healing of fracture were used to detect fracture healing by X-ray and to measure the average bone density of the callus area， the percent trabecular and trabecular width were analyzed by bone histomorphometry and the serum levels of BMP-2， TGF-β1 was determined by ELISA at 1， 2， 3， 4 weeks after the operation. The right healing of fracture were comminuted， and the expression of BMP-2 and TGF-β1 were analyzed by RT-qPCR. Results The X-ray results showed that the fracture healing in the control group was obviously delayed in the experimental group. After 2 weeks， compared with the control group， the callus bone mineral density （BMD） in the experimental group was increased （P < 0.05 or P < 0.01）. The trabecular area ratio and trabecular width in the callus area were markedly increased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the difference was even more increased along with the increasing time. ELISA results showed the serum levels of BMP-2 and TGF-β1 in the experimental group were higher than those in the control group （P < 0.05）. RT-qPCR results showed the expression of BMP-2 and TGF-β1 in the experimental group were higher than those in the control group from the 2nd week after operation （P < 0.01）. Conclusion Danshen Injection can promote the healing of mandibular fracture， which may be related to the transcription and protein expression of BMP-2 and TGF-β1 gene during the process of fracture healing.

[Key words] Danshen Injection； Mandibular fracture； Bone morphogenetic protein-2； Transforming growth factor-β1

下頜骨位于顏面下部，是頜面部體積最大且位置較為突出的骨骼。由于其解剖位置特殊，容易遭受外力而受損傷，據(jù)統(tǒng)計下頜骨骨折發(fā)生率占頜骨骨折的50%～70%[1]。下頜骨骨折愈合過程又較為復雜，受諸多因素的影響[2]，如飲食、年齡、損傷程度等。如何加快下頜骨骨折愈合成為口腔頜面外科醫(yī)生關(guān)注的焦點。近年來，隨著醫(yī)學的發(fā)展，研究人員對下頜骨骨折愈合機制的認識不斷拓展，中醫(yī)藥治療下頜骨骨折取得了良好的效果。

丹參具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩之功效，是一味重要的中藥。前期研究表明，丹參能擴張血管、增加血流量，改善骨折處局部微循環(huán)[3-4]；促進成骨細胞增殖、分化[5-6]、同時抑制破骨細胞活性[7-8]。本研究基于前人理論，選用丹參注射液觀察其對大鼠下頜骨骨折愈合的影響，并探討其在下頜骨骨折愈合過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠48只，體重（250±50）g，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2008-00051。大鼠自由飲水進食，標準普通飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學院動物實驗中心清潔動物房，室溫23～25℃，相對濕度50%～70%。

1.2 試劑與器械

丹參注射液（四川升和藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號：160523），骨形成蛋白-2（BMP-2）及轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（重慶鼎國生物有限公司，生產(chǎn)批號均為201608），數(shù)字X線平片機（SIEMENS，德國），KDIS影像處理軟件，RM2235型石蠟切片機（Leica，德國），ABI7500型PCR儀，低速離心機（TD6M，高科儀器）。

1.3 方法

1.3.1雙側(cè)下頜骨骨折的建立 大鼠通過手術(shù)建立雙側(cè)下頜骨骨折模型[9]，10%水合氯醛以3 mL/kg劑量進行大鼠腹腔麻醉后，剪去大鼠兩側(cè)下頜區(qū)及頸上部毛，暴露下頜體下緣及其頰舌側(cè)面，以下頜第三磨牙后對應的下頜骨下緣為定點，髁狀突頂點與定點，用低速手機（1500 r/s）制造寬1 mm，深3 mm的頰舌側(cè)貫通的不完全離斷性骨折模型。術(shù)中不斷用生理鹽水沖洗、冷卻，術(shù)后將皮膚、皮下組織分層縫合。并與術(shù)后當日給予青霉素抗感染（1 mol/L，20 U/d），連續(xù)3 d。

1.3.2 動物分組 48只大鼠按隨機數(shù)字表法分為實驗組和對照組，每組24只，常規(guī)飲食。在造模3 d后，實驗組每天腹腔注射丹參注射液（1 mL/kg），對照組每天腹腔注射等計量生理鹽水。

1.3.3 血清BMP-2、TGF-β1測定 術(shù)后第1、2、3、4周時，用水合氯醛麻醉大鼠，心臟取血，4℃靜置4 h，離心機轉(zhuǎn)速4000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min后，提取血清，檢測BMP-2、TGF-β1含量。

1.3.4 X線檢查及骨痂區(qū)骨密度檢測 術(shù)后第1、2、3、4周時，取右側(cè)下頜骨標本，于X線機下拍攝正位片，觀察骨折愈合程度；用KDIS影像處理軟件對骨痂區(qū)行骨密度檢測，計算出骨痂區(qū)的平均骨密度值。

1.3.5 骨痂區(qū)組織形態(tài)計量學測定 將X線檢查后骨痂標本置于4%的多聚甲醛液中固定（48 h），PBS沖洗，然后在4℃下用EDTA溶液脫鈣，可以用大針頭輕輕刺進去者即脫鈣完全[10]。石蠟包埋后切4 μm薄片，HE染色。術(shù)后每個周期，兩組選取6張切片，每個切片選擇3個視野，每組共18個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像測量與分析系統(tǒng)進行骨組織形態(tài)學指標（骨小梁面積百分比、骨小梁寬度）的測量[9]。

1.3.6 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 按呂桂浩等[11]的方法，各組動物分批處死同時迅速取左側(cè)下頜骨骨折處100 mg骨痂組織，液氮速凍、保存，并提取骨痂組織總RNA。引物由上海生工涉及、合成，引物序列見表1。按PrineScript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進行RT-PCR，擴增反應采用20 μL體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ（Tli RnaseH Plus） 10 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6 μL。循環(huán)參數(shù)：模板cDNA 95℃預變性30 s后進行循環(huán)。變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，共進行40個循環(huán)。反應結(jié)束后，采用Delta-delta Ct法計算目的基因表達變化[12]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 X線檢查

骨折后，各時間點的X線檢查結(jié)果見圖1。術(shù)后1周時各組下頜骨骨折線較為明顯；術(shù)后2、3周時，實驗組骨折線開始變模糊，對照組骨折線較實驗組清晰；術(shù)后第4周時，實驗組骨折線顯影與周圍組織十分相近，界限不太清晰，對照組的骨折線仍然比較明顯。

2.2 骨密度檢測

隨著實驗進行，兩組骨痂組織的BMD逐漸增加。從術(shù)后第2周開始，與對照組比較，骨折后各時間點實驗組骨痂BMD明顯高于對照組（P < 0.05或P < 0.01）。見圖2。

2.3 骨痂區(qū)組織形態(tài)計量學

隨著實驗進行，兩組骨痂區(qū)各識相點骨小梁的面積比、骨小梁的寬度逐漸增加。從術(shù)后第2周開始，與對照組比較，實驗組骨痂區(qū)在各時相點骨小梁的面積比、骨小梁的寬度均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。見圖3。

2.4 兩組大鼠血清BMP-2、TGF-β1變化情況

與對照組比較，實驗組各時相點濃度較高（P < 0.05或P < 0.01），且在術(shù)后第3周時，實驗組中血清BMP-2、TGF-β1濃度達到峰值，之后血清BMP-2、TGF-β1濃度開始下降。見圖4。

2.5 兩組大鼠BMP-2 mRNA、TGF-β1 mRNA變化情況

從術(shù)后第2周開始，與對照組比較，實驗組各時間點BMP-2 mRNA、TGF-β1mRNA表達量均高于對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），術(shù)后第3周時，實驗組BMP-2 mRNA、TGF-β1 mRNA表達量最高，之后BMP-2 mRNA、TGF-β1 mRNA的表達開始下降。見圖5。

3討論

下頜骨骨折是口腔頜面外科常見的疾病，并且以男性多見，而交通事故在致傷原因中居于首位[13]。目前，下頜骨骨折治療臨床應用較多的是堅強內(nèi)固定（RIF）技術(shù)，雖然具有一定的效果，但是容易造成患者咬合關(guān)系紊亂及頜面部畸形[14]。研究表明，骨折的愈合是一個復雜的組織學、生物學、內(nèi)分泌學及生物力學的動態(tài)過程，按組織學變化分為3個階段：血腫機化期、原始骨痂形成期、骨痂改造塑形期[15]。每個過程都有明顯的組織學和生理學特征，該過程是各種因素相互協(xié)同、相互拮抗的結(jié)果[16]。

丹參性味苦，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消腫之功效。丹參以其療效確切、副作用小，被廣泛應用與臨床各類疾病[17-20]。前期研究表明，丹參具有擴張血管、增加血流量，改善骨折處局部微循環(huán)[21]，故丹參對骨折愈合的作用是肯定的。但是丹參在下頜骨愈合過程中分子作用機制尚不清楚。

骨力學強度和骨密度有很大相關(guān)性，體現(xiàn)了骨組織的密度。所以，骨折愈合的程度主要表現(xiàn)在骨密度的變化[16]。本實驗X線片發(fā)現(xiàn)，對照組骨折愈合明顯延遲于實驗組，實驗組的BMD值增加明顯高于對照組，并且隨著時間的變化，差異更加顯著。骨小梁的面積比反映骨量的多少，是評價骨量變化的重要指標；骨小梁的寬度反映骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)，解釋骨量變化[22]。組織形態(tài)計量學顯示，從術(shù)后第2周開始，實驗組明骨痂區(qū)骨小梁的面積比，骨小梁的寬度明顯提高，提示丹參能夠促進骨痂區(qū)骨小梁的形成，增加骨折區(qū)骨量，這與X線片觀察結(jié)果一致。

大量實驗研究表明，BMP-2及TGF-β1在骨折愈合過重中發(fā)揮重要的作用。BMP-2屬于TGF-β超家族成員。在早期發(fā)育期間，BMP-2與其BMPs受體結(jié)合，誘導間充質(zhì)干細胞分化成軟骨細胞和成骨細胞，參與骨及軟骨發(fā)育，促進骨組織生長、發(fā)育及骨折愈合[23-24]。此外，BMP-2還有促進血管再生[25]。TGF-β1可刺激間充質(zhì)干細胞增殖、分化，誘導間充質(zhì)干細胞分化成成骨細胞[26]及軟骨細胞[27]，促進骨生成及軟骨修復。同時，在血腫機化期，血小板釋放TGF-β1能刺激骨膜生發(fā)層細胞使其增殖[28]。ELISA結(jié)果顯示：實驗組各時間點血清BMP-2、TGF-β1濃度均高于對照組。其中實驗組血清BMP-2、TGF-β1的濃度在第1～3周逐漸增加，并在第3周達到峰值，之后逐漸下降；對照組血清BMP-2、TGF-β1的濃度在術(shù)后第2周達到峰值，之后逐漸下降。PCR結(jié)果顯示：從術(shù)后第2周開始，各時間點實驗組BMP-2 mRNA、TGF-β1 mRNA的表達量明顯高于對照組，并且在術(shù)后第3周時，BMP-2 mRNA、TGF-β1 mRNA表達量最高，之后逐漸下降；對照組中BMP-2 mRNA、TGF-β1 mRNA表達量在術(shù)后第2周時最高，之后逐漸下降。提示丹參不僅能增加BMP-2、TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達，而且還能延長其表達峰值時間，在骨折愈合過程中BMP-2、TGF-β1可能存在相互作用。

本實驗通過研究丹參注射液對大鼠下頜骨骨折影響，并測定了BMP-2、TGF-β1血清濃度及骨痂組織中mRNA的變化，提示丹參能夠促進大鼠下頜骨骨折愈合，可能與丹參促進BMP-2、TGF-β1基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達有關(guān)，從而為丹參促進下頜骨骨折愈合的機制提供佐證。值得注意的是，骨折愈合是一個復雜的過程，需要多種骨生長因子共同參與、協(xié)調(diào)才能完成。在后期的實驗中將進一步通過分子生物學實驗研究丹參促進下頜骨骨折愈合的機制，為丹參在臨床中更好應用提供理論依據(jù)。

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