楊一凡，謝青貞

(武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學臨床研究中心，武漢 430060)

跨膜蛋白16A(TMEM16)屬于“未知功能的跨膜蛋白16”一族，因其家族為陰離子通道(anion)并預測有8個跨膜區(qū)片段(octa)，故其又稱為anoctamin 1(ANO1)。TMEM16A的基因定位于人類染色11q13區(qū)域，此區(qū)域的很多基因在上皮類癌癥如乳腺癌、肺癌和口腔上皮癌中高表達，因此在被確認為鈣激活氯離子通道(CaCCs)的分子基礎之前，TMEM16A主要在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等相關研究中被大家熟知[1-2]。2008年CELL、SCIENCE和NATURE三個頂級期刊同時確定了TMEM16A為CaCCs的分子基礎，自此其作為CaCCs分子基礎的相關研究得以展開[3-5]?，F(xiàn)已知TMEM16A在唾液腺、氣管、血管平滑肌、胃腸道等多種器官和組織中廣泛表達，并在多種生理反應過程中起著重要的作用[6-9]。在生殖道中，TMEM16A被發(fā)現(xiàn)在小鼠利用特異性氯通道抑制劑能明顯減弱小鼠子宮平滑肌的自發(fā)性收縮；在小鼠卵巢顆粒細胞的質膜上同樣發(fā)現(xiàn)了TMEM16A的存在，通過激活MEK/ERK途徑從而下調芳香化酶的表達進而抑制雌激素的合成[10]；TMEM16A還可能參與了輸卵管對精子、卵母細胞和受精卵的運輸過程[11]。雖然TMEM16A在以上生殖道組織和器官中被證實表達并發(fā)揮一定的生理功能，但在正常人子宮內膜上的表達及其相關功能研究卻鮮有報道。目前僅有我們前期的研究結果顯示TMEM16A在人正常月經周期子宮內膜增殖期和分泌期呈差異性表達[12]，提示其可能受雌、孕激素的調節(jié)，參與子宮內膜容受性的建立。本研究擬通過體外實驗探討雌、孕激素在子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系中對TMEM16A的表達調節(jié)。

材料和方法

一、主要材料和試劑

人子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系由華南農業(yè)大學楊增明教授饋贈。無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國)、胎牛血清(Gibco，美國)、Q-PCR逆轉錄試劑盒(Takara Bio，日本)、SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara Bio，日本)、兔抗人多克隆TMEM16A一抗(Abcam ab72984，英國)和山羊抗兔二抗(ASPEN AS1107，武漢)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物，上海)、5×蛋白上緩沖液(賽維爾生物，武漢)、內參β-actin(賽維爾生物，武漢)、雌二醇(E2，Sigma，美國)、孕酮(P4，Sigma，美國)。

二、實驗方法

1.子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系培養(yǎng)和分組：子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系為貼壁細胞，細胞復蘇后置于10%胎牛血清的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代，將細胞按2×106個/孔的密度均勻種在6孔板上，培養(yǎng)24 h，用含0.5%炭吸附胎牛血清的無酚紅RPMI-1640饑餓處理，24 h后根據(jù)實驗目的和實驗方法對細胞進行分組和相應處理。

2.免疫熒光(Immunofluorescence)檢測TMEM16A在子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系中的定位：將細胞按2×105個/cm2的密度種在有無菌蓋玻片的6孔板中，置于10%胎牛血清的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2培養(yǎng)。待細胞融合度達到40%～50%后，用預溫的PBS洗滌蓋玻片3次，每次5 min。用4%多聚甲醛室溫固定30 min，其后，小心取出蓋玻片，放入封閉液，37℃，60 min。輕輕甩掉封閉液，在玻片上滴加用PBS配好的兔抗人多克隆抗體TMEM16A一抗(1∶200)，玻片平放于濕盒內4℃孵育過夜。玻片置于PBS中在搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。玻片稍微甩干后加入山羊抗兔二抗(1∶200)，避光室溫孵育60 min。將玻片置于PBS中在搖床上晃動洗滌3次，每次5 min，稍甩干后滴加DAPI染色，避光室溫孵育10 min。熒光封片液封片后置于倒置顯微鏡下觀察并采集圖片。

3.實時熒光定量(Q-PCR)檢測各組TMEM16A mRNA在人子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系中的表達：細胞饑餓處理24 h后，將細胞分為E2組、P4組、E2+P4組和空白對照組。E2組加入10-8mol/L E2；P4組加入10-6mol/L P4；E2+P4組加入10-8mol/L E2和10-6mol/L P4；空白對照組加入0.1%二甲基亞砜(DMSO)。各組分別培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，按Trizol試劑說明提取各組細胞的總RNAs，測定各組總RNAs濃度和OD值，若OD值在1.8～2.2之間，取1 μg各組總RNA，按照逆轉錄說明書，利用逆轉錄試劑盒去除基因組DNA，總體系為10 μl。隨后對總RNAs進行逆轉錄反應，反應體系為20 μl，逆轉錄后的cDNA進行Q-PCR檢測，實驗獨立重復3次。Q-PCR所用引物見表1。

表1 Q-PCR所用引物

4.Western blotting檢測各組TMEM16A蛋白質在人子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系中的表達：細胞饑餓處理24 h后，將細胞分為E2組、P4組、E2+P4組和空白對照組。E2組加入10-8mol/L E2；P4組加入10-6mol/L P4；E2+P4組加入10-8mol/L E2和10-6mol/L P4；空白對照組加入0.1% DMSO。各組分別培養(yǎng)48 h，用TBS緩沖液潤洗貼壁細胞2～3次，最后一次盡量吸干殘留液。加入80 μl的細胞總蛋白提取試劑于6孔板內裂解3～5 min。用細胞刮刀將細胞刮下，收集到1.5 ml離心管中。冰浴30 min，4℃13 000g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品的蛋白濃度，加入適量5×蛋白上緩沖液后煮沸8 min使蛋白變性，使用12% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣本，然后將凝膠上分離的蛋白電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別滴加兔抗人TMEM16A多克隆抗體一抗(1∶1 000)，內參β-actin(1∶1 000)，均4℃孵育過夜。PBS漂洗3遍后，二抗室溫孵育1 h(1∶5 000)，再次用PBS漂洗3遍，使用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃膜并分析條帶。實驗獨立重復3次。

三、數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0軟件，計量資料多組比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組計量資料比較采用非配對t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、TMEM16A蛋白質在子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系中的定位

免疫熒光結果顯示Ishikawa細胞的細胞核被DAPI染成藍色(圖1A)；TMEM16A蛋白質在Ishikawa細胞的細胞膜、細胞質及細胞核上均有表達，且主要集中在細胞膜上(圖1B)。

A：DAPI染色的細胞核(×200)；B：TMEM16A染色(×200)；C：細胞核和TMEM16A合并(×200)圖1 TMEM16A蛋白質在子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系中的熒光染色結果

二、E2、P4對人子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系中TMEM16A mRNA表達的影響

Q-PCR結果顯示了E2和P4對人子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系中TMEM16A mRNA表達的影響(圖2)。與空白對照組相比，不論是E2組、P4組或E2+P4組均可顯著提高Ishikawa細胞系中TMEM16A mRNA的表達水平(P<0.01)。其中，E2+P4組TMEM16A mRNA的表達水平較E2組和P4組顯著升高(P<0.01)；P4組TMEM16A mRNA的水平較E2組顯著升高(P<0.01)。

圖2 各組TMEM16A mRNA在子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系中的表達水平，**P<0.01

三、E2、P4對人子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系中TMEM16A 蛋白質表達的影響

Western blotting結果顯示了E2和P4對人子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系中TMEM16A 蛋白質表達的影響(圖3)。與空白對照組相比，E2組、P4組或E2+P4組均可顯著提高Ishikawa細胞中TMEM16A蛋白的表達水平(P均<0.05)。其中，E2+P4組TMEM16A 蛋白的表達水平較E2組和P4組均顯著升高(P均<0.05)。P4組TMEM16A 蛋白水平較E2組高(P<0.05)。

圖3 各組TMEM16A 蛋白質在子宮內膜腺癌Ishikawa細胞系中的表達及水平比較，*P<0.05，**P<0.01

討 論

Ishikawa細胞系是高分化的人子宮內膜腺癌細胞，因其具有E2、P4受體以及正常子宮內膜上皮細胞的相關特性而被用于子宮內膜上皮細胞功能的相關研究[13-14]。TMEM16A現(xiàn)已被證實存在于多種組織和器官中，但在子宮內膜中的表達和相關功能尚不明確。目前，僅有我們前期的研究結果顯示TMEM16A在人正常月經周期不同時期的子宮內膜中存在表達差異，并可能受E2、P4的調節(jié)。

為了進一步確定TMEM16A在子宮內膜細胞中的表達以及受E2、P4的調節(jié)作用，我們在體外培養(yǎng)的Ishikawa細胞系中，首先利用免疫熒光確定了TMEM16A在Ishikawa細胞系上存在表達，且主要定位于細胞膜上。

子宮內膜受卵巢甾體激素E2和P4的影響而發(fā)生周期性的變化。在E2、P4的作用下，包括信號轉導分子、粘附分子、各種細胞因子和生長因子等在內的許多分子在不同時期的子宮內膜中呈時空特異性表達。E2、P4對細胞功能的調節(jié)主要通過以下兩條途徑，即經典的基因組學途徑和非基因組學途徑。基因組學途徑又稱慢作用途徑，E2、P4通過與胞內的受體結合后進入細胞核，與特定的DNA序列結合后，上調或下調相關基因的表達；非基因組學途徑下，雌、孕激素可與細胞膜上相應的受體結合，激活細胞內的Ca2+作為第二信使，完成信號傳遞，使E2、P4在短期內產生效應[15]。另有研究證明，E2、P4還可以通過非基因組學效應激活細胞內Ca2+的釋放[16-17]。當胞漿內的Ca2+達到一定的濃度時，TMEM16A作為CaCCs的分子基礎，與Ca2+結合激活CaCCs，從而氯離子通道開放。但TMEM16A與Ca2+的相關結合位點及激活的相關機制仍不明確。基于以上的研究發(fā)現(xiàn)，我們推測當E2、P4與子宮內膜細胞上的相應受體相結合時，可以激活胞漿內Ca2+的釋放，Ca2+又作為第二信使參與E2、P4對細胞的調節(jié)。

為了確定E2和P4對Ishikawa細胞系中TMEM16A的表達具有調節(jié)作用，我們在體外培養(yǎng)Ishikawa細胞系中分別用E2、P4和E2+P4進行干預處理48 h，其后，通過Q-PCR技術和Western blotting技術檢測Ishikawa細胞系中TMEM16A mRNA和蛋白的表達情況。實驗結果顯示，與空白對照組相比，不論是E2、P4單獨處理或E2+P4聯(lián)合處理均可顯著提高Ishikawa細胞系中TMEM16A mRNA的表達(P均<0.05)。E2+P4組TMEM16A的表達最高，與E2或P4單獨處理相比有顯著性差異(P均<0.01)，并且P4組TMEM16A的表達高于E2組(P<0.01)。Western boltting結果顯示TMEM16A蛋白質的變化趨勢與mRNA的變化趨勢基本一致。以上結果說明在Ishikawa細胞系中TMEM16A的表達水平受到E2和P4的調節(jié)，兩種激素同時作用時表達水平最高，提示P4的調節(jié)作用有可能大于E2，但仍需進一步研究確定。

當子宮內膜處于分泌中、晚期時(月經第20～24天)，E2和P4的分泌達到高峰，此時子宮內膜容受性最高，只在這個特定的時期，活化的胚胎才能在子宮內膜上進行定位、粘附和侵入，順利完成著床，這個特定的時期成為“窗口期”?！按翱谄凇痹贓2和P4的協(xié)同調控下，生長因子、粘附分子等諸多因子被激活并相互對話，包括白血病抑制因子(LIF)和整合素av β3等子宮內膜容受性標志性分子在此階段呈高表達狀態(tài)。

綜上，本研究結果提示TMEM16A可能作為胚胎著床的關鍵信號分子之一參與子宮內膜容受性的建立，也有可能是雌、孕激素通過非基因組學途徑刺激胞內Ca2+的釋放，導致TMEM16A的激活，這仍需進一步研究。