張寧媛，黃國寧，范立青，馮云，沈浣，劉平，盧文紅，張云山，王秀霞，張松英，黃學(xué)鋒，伍瓊芳，全松，周燦權(quán)，周從容，師娟子，孫瑩璞，孫海翔

(中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會第四屆委員會)

背 景

遺傳性疾病是出生缺陷的主要形式，絕大部分遺傳性疾病缺乏有效治療方法，是人類生殖健康面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。植入前遺傳學(xué)診斷/篩查(preimplantation genetic diagnosis/screening，PGD/PGS)是在胚胎植入子宮前對胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測，選擇正?；蛘卟恢虏∨咛ヒ浦?。PGD主要針對事先已經(jīng)明確病因的遺傳性疾病患者，在種植前對胚胎進(jìn)行相應(yīng)遺傳學(xué)診斷，主要包括單基因病(如地中海貧血、遺傳性耳聾等)和染色體病(如羅氏易位、相互易位等)。而PGS主要針對高齡、反復(fù)助孕失敗、反復(fù)自然流產(chǎn)等患者，進(jìn)行植入前胚胎的染色體非整倍性檢測。

PGD/PGS技術(shù)從源頭上避免了遺傳性缺陷胚胎的種植，較之傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查具有明確的時間優(yōu)勢，避免可能的治療性引產(chǎn)給母體帶來的生理、心理傷害以及倫理問題。PGD/PGS技術(shù)的設(shè)想最早由Edwards提出，1968年開始動物試驗[1]，此后不斷拓展。PGD/PGS技術(shù)的臨床應(yīng)用已有近30年的歷史。伴隨胚胎培養(yǎng)與活檢技術(shù)、新型高通量診斷方法的發(fā)展，PGD/PGS的臨床應(yīng)用范圍更加廣泛。如何減少體外操作對胚胎發(fā)育潛能的影響，同時提高檢測結(jié)果的可靠性，仍是PGD/PGS實驗室技術(shù)中亟待規(guī)范的問題。

方 法

在中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會的倡議和領(lǐng)導(dǎo)下，分析1973～2016年Medline引文出版的臨床試驗主要證據(jù)與薈萃分析結(jié)果，以“preimplantation genetic diagnosis”或“preimplantation genetic screening”為MeSH Terms，檢出文獻(xiàn)2 746篇。參照歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(European Society for Human Reproduction and Embryology，ESHRE)PGD分會2005年發(fā)布的PGD/PGS臨床指南[2]、2011年發(fā)布的PGD中心組織管理[3]、基于擴增方法的檢測技術(shù)[4]、基于FISH方法的檢測技術(shù)[5]和活檢技術(shù)[6]等4個方面的指南，以及美國PGD國際協(xié)會(Preimplantation Genetic Diagnosis International Society，PGDIS)2008 年修訂的PGD操作流程及實驗室質(zhì)量保障指南[7]、中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會2017年試行的“高通量基因測序植入前胚胎遺傳學(xué)診斷和篩查技術(shù)規(guī)范(試行)”[8]，由中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會實驗室學(xué)組的專家共同討論，制定此PGD/PGS實驗室技術(shù)指南，以期規(guī)范PGD/PGS相關(guān)實驗室技術(shù)的實踐與管理。

一、指南發(fā)起和支持單位

本指南由中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會發(fā)起和負(fù)責(zé)制訂。

二、指南注冊與計劃書撰寫

本指南已在國際實踐指南注冊平臺(International Practice Guidelines Registry Platform，IPGRP)進(jìn)行了注冊(注冊號為IPGRP-2017CN040)，讀者可聯(lián)系該注冊平臺索要指南的計劃書。

三、指南使用者與目標(biāo)人群

該指南適用于開展胚胎植入前遺傳學(xué)診斷與篩查技術(shù)的醫(yī)療機構(gòu)。指南的使用人群為從事生殖醫(yī)學(xué)和婦產(chǎn)科學(xué)的醫(yī)務(wù)工作者。

四、證據(jù)評價與分級

依據(jù)循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的五級證據(jù)等級進(jìn)行分級。Ⅰ級證據(jù)來源：按照特定病種的特定療法收集所有質(zhì)量可靠的RCT以及對其所做的系統(tǒng)性評價或Meta分析；Ⅱ級證據(jù)來源：單個的樣本量足夠的RCT研究；Ⅲ級證據(jù)來源：設(shè)有對照組但未用隨機方法分組的研究；Ⅳ級證據(jù)來源：無對照的系列病例觀察；Ⅴ級證據(jù)來源：專家意見、個案報道和臨床總結(jié)。

主要推薦意見證據(jù)級別分為：A級：強力推薦(證據(jù)肯定，能改善健康結(jié)局，利大于弊)；B級：推薦(有較好證據(jù)，能改善健康結(jié)局，利大于弊)；C級：不作為常規(guī)推薦(有證據(jù)能改善健康結(jié)局，但無法明確風(fēng)險獲益比)；D級：不推薦(證據(jù)不足或?qū)】到Y(jié)局弊大于利)。

五、指南的傳播與實施

指南發(fā)布后，將主要通過以下方式對指南進(jìn)行傳播和推廣：①在相關(guān)學(xué)術(shù)會議中進(jìn)行解讀；②有計劃地在中國部分省份組織指南推廣專場，確保醫(yī)務(wù)工作者充分了解并正確應(yīng)用本指南；③在學(xué)術(shù)期刊中發(fā)表本指南；④通過微信或其他媒體進(jìn)行推廣。

結(jié) 果

表1 主要推薦意見

一、PGD/PGS實驗室管理

指南意見：PGD/PGS實驗室應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程和人員專項培訓(xùn)制度。

PGD/PGS實驗室應(yīng)建立在經(jīng)省級醫(yī)療行政管理部門批準(zhǔn)開展植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)的試點或正式運行的醫(yī)療機構(gòu)。PGD/PGS實驗室應(yīng)具備的場地、設(shè)備、人員要求參照中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會的“高通量基因測序植入前胚胎遺傳學(xué)診斷和篩查技術(shù)規(guī)范(試行)”[8]。

PGD/PGS實驗室應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程。PGD/PGS操作手冊應(yīng)包括授精與胚胎培養(yǎng)、胚胎活檢、遺傳學(xué)檢測、胚胎凍融、胚胎移植等相關(guān)技術(shù)流程和操作細(xì)節(jié)要求，并及時更新，定期進(jìn)行自查。

PGD/PGS針對的是單細(xì)胞或幾個細(xì)胞的微量DNA，遺傳診斷的難度大，對診斷結(jié)果的可靠性要求也更高。因技術(shù)的特殊要求，PGDIS推薦對PGD/PGS實驗室技術(shù)人員進(jìn)行嚴(yán)格的專項培訓(xùn)。為避免外源性細(xì)胞或DNA污染，在實施PCR操作時尤其需要嚴(yán)格遵循操作規(guī)范。在缺少單細(xì)胞診斷正規(guī)培訓(xùn)的情況下，生殖中心可通過強化安全教育和操作流程的監(jiān)督，使其嚴(yán)格落實標(biāo)本標(biāo)記及確認(rèn)的雙人核對制度；通過加強對儀器與操作技術(shù)的訓(xùn)練，使其熟練掌握授精與胚胎培養(yǎng)、胚胎活檢等核心操作技術(shù)；通過數(shù)據(jù)收集與分析水平的訓(xùn)練，使其提高PGD結(jié)果的判別技能以甄選可供移植的胚胎。PGD/PGS檢測應(yīng)嚴(yán)格遵守國家法律及衛(wèi)生行政部門頒發(fā)的法規(guī)，嚴(yán)格禁止無醫(yī)學(xué)指征的性別篩查，PGD/PGS報告中必須隱藏與胚胎性別相關(guān)的信息。

二、PGD/PGS采用的授精與胚胎培養(yǎng)方式

指南意見：授精采用ICSI方式，以避免親源遺傳物質(zhì)的污染。卵子與胚胎培養(yǎng)采用單滴培養(yǎng)方式，以確保胚胎和活檢材料、活檢結(jié)果一一對應(yīng)。

PGD/PGS患者的授精方式與胚胎培養(yǎng)模式的選擇，需充分考慮到PGD/PGS操作的需要，同時避免父源和母源性遺傳物質(zhì)污染的可能。

1.授精方式：ESHRE PGD協(xié)會統(tǒng)計連續(xù)10年的PGD/PGS數(shù)據(jù)，其中采用ICSI授精方式的有23 830個周期、采用IVF方式3 113個周期[9](Ⅲ級)。絕大部分PGD/PGS周期采用ICSI授精方式，保障受精率同時，避免精子滯留透明帶中造成父源遺傳物質(zhì)的污染[2，9](Ⅲ級)。ICSI前去除顆粒細(xì)胞操作應(yīng)將卵周顆粒細(xì)胞清除干凈以避免母源遺傳物質(zhì)的污染[10]。

2.胚胎培養(yǎng)方式：胚胎活檢之前的培養(yǎng)模式同常規(guī)IVF周期[11]，建議單滴培養(yǎng)?；顧z過程中需要嚴(yán)格標(biāo)識?；顧z后卵子或胚胎行單滴培養(yǎng)，也可以單枚卵子或胚胎放置單獨培養(yǎng)皿，確保活檢標(biāo)本與活檢后卵子或胚胎一一對應(yīng)[6]?；顧z后卵子或胚胎應(yīng)充分洗滌祛除活檢使用的操作液[6]。

三、PGD/PGS采用的卵子與胚胎活檢方法

指南意見：胚胎活檢時機選擇滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢透明帶打孔采用激光法。滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢方法采用激光或機械切割法。滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢數(shù)量要求：滋養(yǎng)層細(xì)胞達(dá)到A級標(biāo)準(zhǔn)可活檢6個以上細(xì)胞，達(dá)不到A級標(biāo)準(zhǔn)時活檢3～6個細(xì)胞。

(一)活檢時機

PGD/PGS是針對植入前胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)診斷，卵子(極體活檢間接反映胚胎遺傳信息)、分裂期胚胎或囊胚三個階段都可以進(jìn)行活檢，獲取遺傳物質(zhì)，進(jìn)行遺傳學(xué)診斷。因此，根據(jù)活檢時機的不同可分為極體活檢、卵裂球活檢和囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。

1.極體活檢：極體活檢包括MⅡ期卵細(xì)胞和/或合子中進(jìn)行極體的活檢，分為第一極體活檢和第二極體活檢。第一極體活檢于取卵當(dāng)天即HCG注射后36～42 h進(jìn)行[12]，第二極體活檢在受精觀察當(dāng)日[13]?？稍谑芫?～22 h內(nèi)同時活檢第一極體和第二極體，但是受精22 h第一極體有可能發(fā)生降解[14](Ⅲ級)。極體活檢用于PGD/PGS基于：極體是卵子減數(shù)分裂過程中的產(chǎn)物，根據(jù)其檢測結(jié)果可以間接推測卵子的遺傳信息，從而預(yù)測來自母親的遺傳缺陷對胚胎的影響。極體活檢相比植入前其他階段具有較少的侵入性，來自第一次減數(shù)分裂的第一極體或來自第二次減數(shù)分裂的第二極體，對于植入前及植入后胚胎的發(fā)育影響較小。Strom等[15]對經(jīng)連續(xù)極體活檢的PGD周期誕生的109個胎兒進(jìn)行生產(chǎn)和新生兒結(jié)局的調(diào)查，結(jié)果顯示經(jīng)雙極體活檢后出生胎兒的身長和體重,以及出生缺陷方面都沒有顯著差異(Ⅲ級)。

由于極體活檢只能間接反映母方遺傳信息，臨床應(yīng)用較為局限。由于有絲分裂和父系來源的非整倍體性不能被檢測到，Capalbo等[16]報道極體活檢具有較高的假陽性和假陰性率(Ⅲ級)。同時極體活檢尚不能預(yù)測胚胎的發(fā)育狀況，活檢樣本量多，也存在無效活檢。極體活檢結(jié)果也需要胚胎活檢結(jié)果的驗證[6]。近幾十年來，歐洲極體活檢的比例已由原先的10%～15%進(jìn)一步下降。

2.卵裂球活檢：卵裂球活檢是在胚胎發(fā)育6～8細(xì)胞左右時，吸取1～2個卵裂球進(jìn)行遺傳學(xué)檢測。此階段的卵裂球被認(rèn)為具有全能性。與極體活檢相比，卵裂球活檢的優(yōu)勢在于可以同時診斷父方和母方染色體異常或單基因疾病。卵裂球活檢直接檢測胚胎的遺傳信息，并且可以剔除未受精和質(zhì)量差的胚胎，減少活檢樣本數(shù)量[17]。但分裂期胚胎活檢減少胚胎細(xì)胞數(shù)量，可能損傷胚胎，降低胚胎發(fā)育潛能[18](Ⅱ級)。分裂期胚胎有40%～60%為嵌合體，對于嵌合體胚胎，卵裂階段單個卵裂球的檢測并不能完全代表整個胚胎的遺傳信息，導(dǎo)致漏診和異常胚胎的移植[6]。

3.滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢：滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢是在受精后5～6 d，胚胎發(fā)育至囊胚階段時，取一定數(shù)量的滋養(yǎng)層細(xì)胞用于遺傳檢測。囊胚階段胚胎細(xì)胞數(shù)量顯著增加，獲得的滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)可達(dá)10個，能夠提供更多的細(xì)胞用于檢測，從而提高PGD/PGS診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。此階段胚胎嵌合減少，也提高了檢測的準(zhǔn)確性，并且滋養(yǎng)層細(xì)胞將來發(fā)育成胎盤，降低了活檢對胚胎發(fā)育的影響[6]。但滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢需要胚胎發(fā)育到囊胚階段，要求具備一定的胚胎培養(yǎng)條件，胚胎有持續(xù)發(fā)育能力。約有40%的正常受精卵可在體外發(fā)育至囊胚階段，也限制了可供PGD/PGS診斷的胚胎數(shù)目。滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢結(jié)果也可能存在與內(nèi)細(xì)胞團的不一致性。

卵裂球活檢和滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢是常用的胚胎活檢時機。隨機配對試驗結(jié)果顯示，囊胚活檢沒有降低胚胎種植潛能(囊胚活檢與未活檢者的種植率為51% vs.54%)，而分裂期胚胎活檢顯著降低了胚胎種植潛能(分裂期胚胎活檢與未活檢者的種植率為30% vs.50%)[19](Ⅱ級)。比較囊胚活檢(Day5活檢，Day6移植)和分裂期胚胎活檢后培養(yǎng)至囊胚移植(Day3活檢，Day5移植)的臨床結(jié)局顯示，囊胚活檢的診斷率和胚胎種植率均高于分裂胚活檢(94.3%、47.6% vs.75.2%、26.7%)[20](Ⅱ級)。鑒于囊胚期活檢的優(yōu)勢，越來越多的PGD/PGS周期采用滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢方式。

(二)活檢方法

PGD過程中的胚胎活檢是一種創(chuàng)傷性顯微操作，有可能影響活檢后胚胎發(fā)育能力。在進(jìn)行胚胎活檢之前需要在透明帶上打孔或者部分透明帶切除。

1.透明帶打孔方法：透明帶打孔主要有3種方法：化學(xué)法、機械法和激光法?；瘜W(xué)法主要是利用酸性液體消化透明帶形成孔洞，由于酸性液體可能會影響胚胎發(fā)育，目前很少應(yīng)用；機械法利用活檢針機械摩擦透明帶，形成孔洞，雖不存在化學(xué)物質(zhì)對胚胎的不利影響，但顯微操作技術(shù)難度相對高，操作時間過長會影響胚胎的細(xì)胞骨架，應(yīng)用也不廣泛；激光法利用激光消除透明帶，操作簡單，可任意調(diào)節(jié)孔洞大小，不直接接觸胚胎，對胚胎發(fā)育影響小，是透明帶打孔最為常用的方法。Magli等[21]報道極體活檢時，機械或者激光法打孔對活檢成功率的影響無統(tǒng)計學(xué)差異 (Ⅲ級)。ESHRE PGD協(xié)會2010年P(guān)GD/PGS病例統(tǒng)計顯示，激光法、化學(xué)法和機械法的應(yīng)用例數(shù)分別為4 250例、958例、443例[22]。

透明帶打孔的時機選擇，極體、分裂期胚胎活檢一般在活檢當(dāng)時進(jìn)行；囊胚期活檢可在第3天或第5天進(jìn)行透明帶打孔[20，23](Ⅱ級、Ⅲ級)。第3天打孔時可以選擇卵裂球與透明帶的間隙處，避免對胚胎細(xì)胞的傷害；第5天時囊胚已經(jīng)擴張，能夠確定胚胎內(nèi)細(xì)胞團所在位置，可以選擇在內(nèi)細(xì)胞團對側(cè)進(jìn)行開口，方便活檢。

2.胚胎活檢方法：對于分裂期胚胎，活檢在無鈣/鎂離子的溶液中進(jìn)行，以降低活檢細(xì)胞裂解的比率[24]?；顧z方法主要有抽吸法、機械切割法和激光切割法。抽吸法直接吸取極體[12]和分裂期卵裂球[25]，對囊胚而言可以在疝形成后使用激光法[21]或機械切割法獲取滋養(yǎng)層細(xì)胞[26]。目前常用的做法是在第3天或第5天時將透明帶開口，待滋養(yǎng)層細(xì)胞從開口處孵出，形成疝，對孵出細(xì)胞進(jìn)行取樣檢測[23，27]。

3.活檢對配子與胚胎質(zhì)量的影響：分裂期胚胎可以活檢1～2個細(xì)胞。相對于活檢對胚胎造成的損傷而言，分裂期胚胎本身的質(zhì)量與囊胚發(fā)育率之間的相關(guān)性更高[18](Ⅱ級)?；顧z2個細(xì)胞較1個細(xì)胞降低囊胚發(fā)育率[18，28](Ⅱ級)。但活檢1個細(xì)胞降低了PCR的診斷效率(88.6% vs.96.4%)，而對FISH方法的診斷效率沒有影響[18](Ⅱ級)。兩者的活產(chǎn)率相當(dāng)[18](Ⅱ級)。

胚胎發(fā)育至囊胚時大約有100～150個細(xì)胞，可以提供更多的細(xì)胞用于檢測。滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢時，診斷率隨活檢細(xì)胞數(shù)的增加而提高，1～5個細(xì)胞的診斷率從86.7%上升到98.7%，當(dāng)活檢細(xì)胞大于6個細(xì)胞時診斷率達(dá)到最大[29](Ⅲ級)。而滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢數(shù)量對臨床結(jié)局的影響則和滋養(yǎng)層本身的發(fā)育狀況緊密相關(guān)，當(dāng)滋養(yǎng)層細(xì)胞達(dá)到A級標(biāo)準(zhǔn)時，活檢細(xì)胞數(shù)量的多少對胚胎存活和種植率沒有顯著影響，而當(dāng)滋養(yǎng)層細(xì)胞在B、C級時，活檢細(xì)胞數(shù)量雖然對胚胎存活沒有顯著影響，但胚胎種植率隨活檢細(xì)胞數(shù)量的增加而下降[29](Ⅲ級)。

研究胚胎活檢對新生兒結(jié)局的影響，顯示胚胎活檢后雖然出生胎齡降低，但活檢本身不會對宮腔內(nèi)生長限制或者低體重造成影響[30](Ⅱ級)。

四、PGD/PGS活檢胚胎的凍融

指南意見：活檢胚胎采用玻璃化冷凍方法保存。

囊胚活檢提供給遺傳學(xué)分析的時間較短，通常需要凍存胚胎[6]。PGD/PGS活檢后胚胎的冷凍與復(fù)蘇方法，參照未活檢胚胎的凍融方法[6]?；顧z后胚胎玻璃化冷凍存活率高于慢速冷凍[31](Ⅱ級)。分裂期胚胎活檢后的冷凍存活率要低于完整胚胎(64.0% vs.92.0%)，而囊胚期胚胎活檢后的冷凍存活率不低于完整胚胎(95.7% vs.81.4%)[32](Ⅲ級)。D3胚胎活檢后培養(yǎng)至囊胚冷凍，D5囊胚的存活率高于D6囊胚[33](Ⅲ級)。因此，行囊胚期玻璃化冷凍是活檢胚胎冷凍保存的可行且有效方法。

活檢胚胎在冷凍過程中要一一對應(yīng)，避免混淆。胚胎編號要與檢測樣本以及診斷報告中保持一致，避免人為的誤診。

五、PGD/PGS的遺傳學(xué)檢測方法

指南意見：染色體疾病的遺傳學(xué)檢測可采用芯片類(如SNP芯片)或者NGS檢測方法。單基因病檢測可采用基因的PCR擴增和/或測序技術(shù)。對突變位點檢測同時在其附近尋找分子標(biāo)記做連鎖分析，以降低PCR方法的誤診率。芯片類方法用于PGS的檢測結(jié)果具有較高的一致性。

(一)常用遺傳學(xué)檢測技術(shù)

胚胎的遺傳學(xué)診斷是PGD/PGS實驗室技術(shù)的重要步驟之一。傳統(tǒng)的單細(xì)胞診斷方法主要有熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。近年來新的遺傳學(xué)診斷技術(shù)，如比較基因組雜交技術(shù)(comparative genomic hybridization，CGH)、單核苷酸多態(tài)芯片檢測技術(shù)(SNP array)、以及新一代測序技術(shù)(NGS)等不斷地應(yīng)用于胚胎的遺傳學(xué)檢測。

1.PCR：PGD最先使用的方法，通過對基因組特定區(qū)域的特異性擴增，結(jié)合凝膠電泳、酶切、測序等技術(shù)，可以檢測胚胎性別、特定基因的點突變、小片段缺失或插入等，也可以通過qPCR檢測染色體整倍性[34]。目前PCR技術(shù)主要應(yīng)用于單基因病的診斷。2014年ESHRE PGD聯(lián)盟通過6個PGD中心的以PCR技術(shù)為主的單基因病PGD數(shù)據(jù)，計算出診斷方法的準(zhǔn)確度為93.7%、敏感度為99.2%、特異度為80.9%[35](Ⅳ級)。PCR技術(shù)面臨污染和等位基因脫扣的挑戰(zhàn)，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果而導(dǎo)致誤診，因此建議和突變點附近的分子標(biāo)記檢測聯(lián)合使用，以降低PCR方法的誤診率[4]。

2.FISH：利用熒光標(biāo)記的特異性探針與處于間期的胚胎卵裂球DNA雜交，在熒光顯微鏡下觀察熒光信號的數(shù)量與分布，反映相應(yīng)染色體的數(shù)目與結(jié)構(gòu)[36]，常用于檢測13、14、15、18、21、22、X及Y染色體的數(shù)目異常。1994年該技術(shù)被首次應(yīng)用于胚胎性別診斷[6]。用DNA插入文庫來篩選結(jié)合鄰近或跨越染色體斷裂位點的DNA探針，為染色體倒位或者平衡易位的攜帶者提供一種檢測手段[37]，卵裂球活檢后檢測染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的異常[38]。傳統(tǒng)的FISH使用的探針數(shù)目有限，僅能檢測部分染色體，不能完全排除胚胎非整倍體的可能性，最近也有將FISH應(yīng)用于24條染色體整倍性檢測的研究報道[39]。此外受卵裂球固定效果和探針的非特異性結(jié)合等影響，檢測結(jié)果難于判斷[40]，有時需要根據(jù)經(jīng)驗做出主觀判斷，影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性，目前該方法有被其它技術(shù)取代的趨勢。

3.CGH：利用不同顏色的熒光標(biāo)記待測樣本和正?；蚪M的DNA，然后與正常人類中期染色體(CGH)或芯片(array CGH，aCGH)進(jìn)行雜交[41]，通過對比分析兩種熒光強度，反映待測樣本DNA信息[42-43]。傳統(tǒng)的CGH需要制備中期染色體，因而目前aCGH應(yīng)用更為廣泛。aCGH可以在基因組水平檢測染色體數(shù)目變化以及重復(fù)、缺失的情況[44]，但是這種方法不能區(qū)分其分辨率以下的片段缺失和重復(fù)，不能檢測整倍性的改變[45-46]，如三倍體胚胎、單親二倍體沒有辦法判斷。

4.SNP array：針對人類基因組平均每500～1 000 bp即含有的1個單核苷酸多態(tài)性位點，對基因組范圍SNP位點的檢測同時可以反映染色體數(shù)目異常及片段異常[47]。SNP芯片檢測的優(yōu)勢在于分辨率高，能夠得到每個胚胎的DNA指紋信息，在分析染色體數(shù)目和片段異常的同時，可以診斷單親二倍體、還可以確定妊娠胎兒是從哪一個胚胎發(fā)育而來[41]。

5.NGS：為新一代測序，相對于傳統(tǒng)的Sanger測序，改變了測序的規(guī)模化進(jìn)程，能對幾十萬到幾百萬條DNA分子同時進(jìn)行測序，但讀長一般較短。將胚胎樣本DNA打斷，構(gòu)建文庫，通過測序后獲得的序列信息與人類基因組數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行比對，可以分析染色體數(shù)量變化與片段異常[48]。2008年后全基因組測序費用呈指數(shù)下降，為NGS的臨床應(yīng)用提供了條件。

(二)遺傳診斷技術(shù)的比較

1.性別鑒定：可以采用PCR技術(shù)對Y染色體重復(fù)序列進(jìn)行鑒定，也可選用FISH技術(shù)。早期研究對比了PCR和FISH在性別鑒定中的可靠性和精確性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR優(yōu)于FISH[49](Ⅲ級)，但FISH在倍性檢測中具有優(yōu)勢[50](Ⅲ級)。

2.染色體結(jié)構(gòu)異常檢測：采用常用商業(yè)探針的FISH技術(shù)，可以區(qū)分平衡和非平衡的胚胎。如需區(qū)分正?；蛞孜坏娜旧w，則需要采用特殊制備的跨斷點探針。aCGH無法檢測出多倍體。相比于傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)，aCGH、SNP array和NGS均無法檢測出DNA拷貝數(shù)無變化的染色體結(jié)構(gòu)變異如平衡易位、倒位等[51](Ⅰ級)。

3.單基因病檢測：可采用基因的PCR擴增和/或測序技術(shù)。單基因病診斷用于特定的遺傳病時，采用特異引物通過PCR技術(shù)診斷。

4.非整倍體篩查：array CGH、SNP array、NGS技術(shù)可以檢測所有染色體的非整倍體和片段異常，已取代多輪雜交FISH技術(shù)。隨機對照研究比較了NGS和aCGH兩種方法行PGS的臨床結(jié)果，發(fā)現(xiàn)NGS能夠100%檢測24條染色體的非整倍體現(xiàn)象，結(jié)果和公認(rèn)的aCGH結(jié)果一致；NGS法行PGS后囊胚移植妊娠率達(dá)到74.7%，胚胎種植率達(dá)70.5%，與aCGH方法沒有顯著差異[52](Ⅱ級)。對aCGH、SNP array和NGS三種方法對24條染色體整倍性檢測的一致性研究顯示，通過對30個囊胚活檢結(jié)果的分析比較，發(fā)現(xiàn)這三種方法對非整倍體胚胎的檢出率均為100%，進(jìn)一步對720條染色體的分析發(fā)現(xiàn)，NGS與aCGH的一致性為99.31%，與SNP array的一致性為99.58%，均具有較高的一致性[53](Ⅲ級)。

六、PGD/PGS實驗室質(zhì)控

指南意見：PGD/PGS實驗室應(yīng)建立嚴(yán)格的內(nèi)部質(zhì)控制度，并獲得PGD資格認(rèn)證。

胚胎活檢的檢出率是PGD/PGS實驗室質(zhì)控的重要指標(biāo)。在2 586枚活檢囊胚中，明確遺傳檢測結(jié)果的有2 437枚，檢出率為94.24%；未檢出囊胚中，30枚為擴增失敗，單細(xì)胞擴增的失敗率為1.16%，可能與滋養(yǎng)層細(xì)胞缺失有關(guān)，也可能細(xì)胞發(fā)生了降解[54](Ⅲ級)。

PGD/PGS在臨床上可以識別的錯誤發(fā)生率較低，但誤診的臨床后果較為嚴(yán)重，導(dǎo)致受到遺傳影響的孩子出生，或者妊娠終止，因此也是PGD/PGS實驗室質(zhì)控的重要指標(biāo)。FISH技術(shù)應(yīng)用于胚胎染色體倍性分析，有報道在30 965例PGD移植周期中出現(xiàn)19例誤診，PGD周期誤診率為0.06%[55](Ⅲ級)，原因主要有探針的雜交失敗、雜交信號重疊與分離造成的判別錯誤；PCR技術(shù)的主要風(fēng)險為等位基因脫扣，有報道在7 759例PGD移植周期中出現(xiàn)12例誤診，PGD周期誤診率為0.15%[54](Ⅲ級)；也有報道在以qPCR方法診斷出的4 794枚判斷為整倍體的囊胚中，移植妊娠后發(fā)現(xiàn)10例差錯，每枚囊胚的誤診率為0.21%[56](Ⅲ級)；以aCGH方法診斷出的579枚判斷為整倍體的囊胚中，移植妊娠后發(fā)現(xiàn)5例差錯，每枚囊胚的誤診率為0.86%[57](Ⅲ級)。NGS技術(shù)的測序錯誤和假陽性結(jié)果與測序深度有關(guān)，隨著測序深度的提升，錯誤率下降。

因?qū)υ\斷結(jié)果的可靠性要求高，PGD/PGS實驗室應(yīng)對技術(shù)人員實施嚴(yán)格的專項培訓(xùn)，強化安全教育和操作流程的監(jiān)督。同時，PGD/PGS實驗室應(yīng)有內(nèi)部質(zhì)控，并盡可能通過外部認(rèn)證。

內(nèi)部質(zhì)控的目的是維持實驗室結(jié)果的穩(wěn)定性。PGD/PGS實驗室應(yīng)建立嚴(yán)格的內(nèi)部質(zhì)控制度，做好質(zhì)控記錄、差錯記錄的管理，并定期組織監(jiān)督，檢查質(zhì)控制度落實情況。定期對技術(shù)操作結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，計算胚胎活檢中細(xì)胞損傷的比例、未得到診斷結(jié)果的細(xì)胞比例。以1年數(shù)據(jù)為依據(jù)，利用未移植胚胎復(fù)查計算誤診率。

外部認(rèn)證是質(zhì)量保障體系的最高標(biāo)準(zhǔn)。PGD/PGS實驗室質(zhì)量的外部認(rèn)證目前尚缺少質(zhì)量認(rèn)證的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。ESHRE PGD聯(lián)盟推薦PGD/PGS實驗室采用ISO 15189或同等級別的標(biāo)準(zhǔn)，并參加所在國家的PGD資格認(rèn)證[4](Ⅴ級)。質(zhì)控方法參照中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會“高通量基因測序植入前胚胎遺傳學(xué)診斷和篩查技術(shù)規(guī)范(試行)”[8]。

總 結(jié)

1.PGD/PGS實驗室管理上，強力推薦建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程，在有效的質(zhì)量管理體系下，建立成熟穩(wěn)定的遺傳檢測相關(guān)技術(shù)，拓展PGD/PGS技術(shù)臨床應(yīng)用的廣度、深度和精度，改善分娩結(jié)局。

2.授精方式強力推薦采用ICSI方式，以避免親源遺傳物質(zhì)的污染。胚胎培養(yǎng)強力推薦采用單滴培養(yǎng)方式，以確保胚胎和活檢材料、活檢結(jié)果一一對應(yīng)。

3.胚胎活檢的時機強力推薦囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。透明帶打孔的方法強力推薦激光法。活檢方法推薦采用激光或機械切割法。滋養(yǎng)層細(xì)胞達(dá)到A級標(biāo)準(zhǔn)推薦活檢6個以上細(xì)胞，達(dá)不到A級標(biāo)準(zhǔn)時推薦活檢3～6個細(xì)胞。

4.活檢胚胎推薦采用玻璃化冷凍方法保存。

5.染色體疾病的遺傳學(xué)檢測可采用芯片類或者NGS檢測方法，單基因病檢測可采用基因的PCR擴增和/或測序技術(shù)，對突變位點檢測同時在其附近尋找分子標(biāo)記做連鎖分析，降低PCR方法的誤診率。

6.推薦PGD/PGS實驗室建立內(nèi)部質(zhì)控，并盡可能通過外部認(rèn)證，保障檢出率，降低誤診率。