周文靜，柴 智，李艷彥，高 麗，閆潤(rùn)紅，周 然，王永輝

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619）

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）為衛(wèi)矛科植物（Celastraceae）雷公藤屬（Tripterygium）一年生藤本植物的干燥根［1］，具有祛風(fēng)止痛、除濕消腫等功效，廣泛用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病，療效確切。但雷公藤有肝毒性，文獻(xiàn)報(bào)道其為單味中藥導(dǎo)致肝損傷的最主要藥物［2］。如何能減輕其肝損傷，提高臨床利用率，是需要解決的問(wèn)題。我們利用中醫(yī)經(jīng)典方劑歸脾湯防治雷公藤醇提物所致大鼠的肝損傷，實(shí)驗(yàn)研究顯示作用明顯［3］。前期研究已從脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、代謝等方面進(jìn)行作用機(jī)理探討［4］，近年來(lái)，肝細(xì)胞線粒體的研

究引起密切關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)觀察了雷公藤所致肝損傷后對(duì)肝線粒體△Ψm和ATP酶水平以及氧化情況的影響，以期進(jìn)一步從肝細(xì)胞線粒體角度研究雷公藤醇提物所致肝損傷的發(fā)生機(jī)制以及歸脾湯的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)動(dòng)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠30只，體質(zhì)量100～120 g，雌雄各半，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2009-0004。動(dòng)物購(gòu)回后雌雄分籠飼養(yǎng)于（22±2）℃、55%濕度環(huán)境中，自由攝水?dāng)z食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥材及雷公藤醇提物的制備 雷公藤藥材由山西省藥品檢驗(yàn)所鑒定為衛(wèi)矛科植物雷公藤的干燥根，來(lái)源于江西九江。將雷公藤藥材干燥，用粉碎機(jī)將藥材粉碎成細(xì)粉，用95%乙醇10倍體積于1 600 g雷公藤細(xì)粉，浸泡12 h，超聲處理45 min，補(bǔ)足重量，離心，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收上清液中乙醇，干燥，取得藥材粉末150.49 g，即為制備好的雷公藤醇提物，計(jì)算得每克提取物相當(dāng)于原雷公藤藥材10.63 g，即提取率為9.41%。歸脾湯（黃芪、人參、白術(shù)、當(dāng)歸、龍眼肉、茯神、酸棗仁、遠(yuǎn)志、木香、甘草）按《證體類要》中提供諸藥比例稱重，藥材購(gòu)自北京同仁堂藥材有限責(zé)任公司。在原藥材中加10倍水，浸泡1 h，水煎煮2次，每次煎煮30 min，合并濾液，用紗布濾除藥渣，濃縮濾液后含生藥1 g/mL，即濃度為100%，藥液4℃保存?zhèn)溆谩?.1.3 儀器與試劑 LR4001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)HEIDOLPH公司），DL-5-B低速大容量離心機(jī)（上海安亭），BS224S型萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)），F(xiàn)ACS Cali bur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），USA1489-2010全自動(dòng)生化分析儀（西門子醫(yī)療診斷有限公司）。凱基細(xì)胞懸液制備試劑盒（批號(hào)KGA829）由南京凱基生物科技有限公司提供，Na+-K+-ATP酶測(cè)試盒（Na+-K+-ATPase，批號(hào)A070-5）、Ca2+-Mg2+-ATP酶測(cè)試盒（Ca2+-Mg2+-ATPase，批號(hào)A070-5）均由南京建成科技有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 分組與造模 將30只健康SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組與歸脾湯組3組，每組10只。歸脾湯組按照9 g/kg劑量灌胃歸脾湯，每天1次，連續(xù)4 d；模型組與空白組灌服等體積的生理鹽水。從第5天開(kāi)始模型組與歸脾湯組大鼠按照3.25 mg/kg劑量灌服雷公藤醇提物，每天1次，連續(xù)3 d，肝損傷造模成功［3］；正常組灌服等體積生理鹽水。

1.2.2 肝組織線粒體的制備 制備大鼠肝線粒體［5］：大鼠末次給藥后禁食12 h，將大鼠處死，迅速?gòu)母伍T靜脈注射預(yù)冷的0.25 M蔗糖溶液，取一部分肝臟組織，剪碎，除去血紅蛋白，用0.25 M蔗糖溶液沖洗3次，剪成勻漿狀；繼續(xù)將預(yù)冷的4倍于肝重的0.25 M蔗糖溶液加入其中，用勻漿機(jī)勻漿，制成肝勻漿；以100 000 g，4℃冷凍離心肝勻漿30 min；取上清液，再將上清液離心60 min，棄去上清液，沉淀用1倍于肝重的甘油-Tris-HCl-KCl緩沖液，渦旋混勻，分裝備用，即為純化的線粒體。

1.2.3 樣品檢測(cè) 取已制備的肝組織，按試劑盒說(shuō)明書操作步驟，測(cè)定肝組織線粒體的SOD、MDA、GSH 的 含 量 以 及 Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性。

檢測(cè)肝細(xì)胞線粒體膜電位，根據(jù)凱基細(xì)胞凋亡線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒的要求，吸取500 μL所配的JC-1工作液加入線粒體沉淀中，將細(xì)胞均勻懸浮，置于37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min；室溫下以 2 000 rpm，離心 5 min，棄去上清，沉積細(xì)胞加入一定量1×Incubation Buffer，漂洗2次，再以2 000 rpm，室溫離心5 min，棄去上清；吸取1×Incubation Buffer 500 μL重新懸浮細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。肝細(xì)胞線粒體膜電位水平以FL1、FL2的雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與門內(nèi)細(xì)胞總數(shù)百分比來(lái)表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織線粒體SOD、MDA、GSH含量的比較

結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肝組織線粒體SOD、MDA、GSH含量的比較（±s）

表1 各組大鼠肝組織線粒體SOD、MDA、GSH含量的比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

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由表1可見(jiàn)，與正常組比較，模型組大鼠的肝組織線粒體 SOD、GSH 水平明顯降低（P＜0.01）；MDA 水平則明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，歸脾湯組大鼠肝組織線粒體GSH、SOD水平提高，MDA 水平降低（P＜0.01）。

2.2 各組大鼠肝組織線粒體ATP酶活性的比較

結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肝組織線粒體ATP酶活性的比較 （μmol·h/μg，±s）

表2 各組大鼠肝組織線粒體ATP酶活性的比較 （μmol·h/μg，±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

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由表2可以看出，與正常組比較，模型組大鼠的肝組織線粒體Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，歸脾湯組可提高大鼠肝組織線粒體Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase水平（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠肝細(xì)胞線粒體膜電位△Ψm水平的比較

結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肝細(xì)胞△Ψm 水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，歸脾湯組大鼠肝細(xì)胞△Ψm水平明顯升高（P＜0.01）；結(jié)果見(jiàn)圖 1，表 3。

圖1 各組大鼠肝細(xì)胞線粒體膜電位△Ψm水平的比較

表3 各組大鼠肝細(xì)胞線粒體膜電位△Ψm的水平比較 （±s）

表3 各組大鼠肝細(xì)胞線粒體膜電位△Ψm的水平比較 （±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

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3 討論

各種肝損傷的發(fā)生與線粒體功能異常有關(guān)，因?yàn)樵S多促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡的信號(hào)主要作用于線粒體。一般通過(guò)改變線粒體膜通透性，抑制氧化磷酸化發(fā)生，下降A(chǔ)TP酶的活性，促進(jìn)生成活性氧，使線粒體發(fā)生變化，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙。而線粒體功能障礙構(gòu)成了細(xì)胞存亡的控制中心，在細(xì)胞壞死和凋亡中都起著重要的作用［6-7］。所以線粒體損傷途徑是肝損傷發(fā)生的重要機(jī)制之一。

線粒體膜電位（△Ψm）可以反映線粒體的通透性，為觀察線粒體功能結(jié)構(gòu)正常與否的靈敏指標(biāo)［8］。線粒體膜電位對(duì)線粒體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定非常重要，當(dāng)線粒體跨膜電位穩(wěn)定時(shí)能夠防止細(xì)胞的凋亡［9］，而細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)就是線粒體跨膜電位的下降。同時(shí)ATP酶產(chǎn)生的最主要場(chǎng)所就在線粒體，ATP酶的產(chǎn)生從而為細(xì)胞正常生命活動(dòng)提供所需絕大多能量［11］。其中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase存在于組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，其活力大小是細(xì)胞功能有無(wú)損傷的重要指標(biāo)［15-16］。另外線粒體是氧自由基生成的主要細(xì)胞器，線粒體的結(jié)構(gòu)與功能受到影響時(shí)，導(dǎo)致過(guò)多的氧自由基啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)或消耗氧自由基清除劑，進(jìn)一步造成細(xì)胞損傷［12］。Mn-SOD、GPx等是線粒體內(nèi)主要抗氧化酶［10］，其中GSH是GPx的底物，又是一種低分子自由基清除劑［13］。當(dāng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和自由基造成線粒體膜損傷時(shí)，會(huì)伴隨ATP酶活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致ATP酶合成不足與線粒體膜流動(dòng)性降低，最終形成肝細(xì)胞的死亡［14］。

結(jié)果顯示，雷公藤醇提物能引起肝細(xì)胞線粒體△Ψm水平下降以及Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低，可能通過(guò)肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)變化與ATP酶的活性下降，氧自由基生成增加，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)物的增加與抗脂質(zhì)過(guò)氧化物的減少，最終造成肝細(xì)胞線粒體的損傷。歸脾湯可防治雷公藤所致肝損傷大鼠肝細(xì)胞線粒體△Ψm的降低，減少脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)物MDA生成，提高肝線粒體ATP酶的活性，進(jìn)一步保護(hù)肝線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，從而提高機(jī)體的抗氧化損傷能力，達(dá)到保護(hù)肝臟作用。