張冉冉，劉 楊，關(guān) 偉，陳 浩，徐慧超，李若瑜，苗宇船

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619）

肝臟是人體重要的代謝器官，其中肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞包括 Kupffer細(xì)胞（Kupffer cells，KCs）、肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞及肝星狀細(xì)胞等，且KCs在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用［1］。因此，有效地原代分離出活性較強(qiáng)的KCs，維持細(xì)胞的基本功能和活性，較好地模擬細(xì)胞在體時的環(huán)境，可對不同動物模型進(jìn)行細(xì)胞學(xué)研究以及外源性物質(zhì)在體代謝和毒性評價。本實(shí)驗(yàn)參考國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，利用不同細(xì)胞的密度差異，優(yōu)化、改良出一種簡便可行、經(jīng)濟(jì)有效，可以分離并培養(yǎng)SD大鼠KCs的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SPF級8 w齡Sprague Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量約（250±10）g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司［許可證號：SCXK（京）2016-0006］?；A(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，不禁水。

1.1.2 主要試劑 水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號2013101801）；肝素鈉注射液（常生千紅生化制藥股份有限公司，批號：160405）；D-hanks（北京索萊寶有限公司，批號：20170206）；Hanks（北京索萊寶有限公司，批號：20170623）；膠原酶Ⅳ（北京索萊寶有限公司，批號：601H132）；RPMI Medium 1640（北京索萊寶有限公司，批號：20171030）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：20170124）；PBS緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司，批號：11D16B30）；Percoll（北京索萊寶有限公司，批號：1208D0432）；封閉用正常山羊血清原液（北京索萊寶有限公司，批號：20171023）；4%多聚甲醛（北京博奧拓達(dá)科技有限公司，批號：170512）；兔抗CD163（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：AG07056442S）；兔抗 CD68（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：AG08109233S）；免疫熒光染色試劑盒-抗兔FITC（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：050417170913）。

1.1.3 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；DMI3000B/DFC450倒置相差顯微鏡、DM4000B/DFC450C熒光顯微鏡（德國Leica公司）；5804R懸垂式冷凍離心機(jī)（德國eppendorf公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司）；PE導(dǎo)管（型號：PE-50，永發(fā)塑料商行）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分離 10%水合氯醛腹腔注射麻醉實(shí)驗(yàn)大鼠，肝素鈉腹腔注射抗凝?！癠”字型打開腹腔，腹主動脈取血后結(jié)扎，常規(guī)制備血漿以備后續(xù)其他實(shí)驗(yàn)。自門靜脈插入PE導(dǎo)管，縫合線結(jié)扎固定，緩慢灌注37℃預(yù)熱的D-hanks，待肝臟腫大后，剪斷下腔靜脈放流，等到無血性物質(zhì)流出，肝臟顏色變淺時，灌注37℃預(yù)熱的0.2 mg/mLⅣ型膠原酶液，灌注過程中分別用微型血管夾夾閉下腔靜脈2～3次，使其在肝臟內(nèi)消化1 min。待肝臟顏色土黃，彈性變差，表面呈龜裂狀時表明灌注完全。摘取肝臟并移至超凈臺下，PBS沖洗后于37℃預(yù)熱的PBS中快速劃碎肝臟，棄除結(jié)締組織。70 μm濾網(wǎng)過濾后，收集細(xì)胞液與0.02 mg/mLⅣ型膠原酶液等體積混合，37 ℃消化 30 min。1000×g（4 ℃）離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，用PBS重懸。細(xì)胞懸液 50×g（4 ℃）離心 3 min，棄肝細(xì)胞沉淀，取上清300×g（4 ℃）離心 5 min，分別收集上清和細(xì)胞沉淀，將沉淀用PBS重懸。將上清1000×g（4℃）離心7 min，沉淀用PBS重懸。將2次重懸的細(xì)胞懸液混合，取1支15 mL離心管，依次加入50%Percoll、25%Percoll、細(xì)胞懸液各 3 mL 及少許 PBS，1800×g（4℃）離心20 min。小心吸取25%Percoll、50%Percoll層及兩層之間的白色細(xì)胞環(huán)，加PBS后300×g（4 ℃）離心 5 min，留上清，再 1000×g（4 ℃）離心7 min。所得沉淀用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液混懸，以適當(dāng)密度接種于4個培養(yǎng)皿中，其中2個用于制備細(xì)胞玻片，另外2個分別進(jìn)行細(xì)胞生長的動態(tài)觀察和吞噬實(shí)驗(yàn)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 h后，用37℃的RPMI 1640培養(yǎng)液洗去未貼壁的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞鑒定

1.2.2 .1 細(xì)胞獲得量及活細(xì)胞率鑒定 將細(xì)胞混懸液與0.4%臺盼藍(lán)染液按1∶1比例充分混勻，鏡下觀察計算細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞數(shù)及活細(xì)胞率。

1.2.2 .2 KCs的鑒定 ①熒光顯微鏡觀察。將剛分離出來的KCs在328 nm波長的激發(fā)光下觀察自發(fā)熒光現(xiàn)象。②免疫熒光染色。將培養(yǎng)24 h的KCs爬片取出，用PBS清洗，4%多聚甲醛室溫固定15 min；PBS再次清洗后用10%封閉用山羊血清37℃封閉1 h；分別加入抗體（兔抗大鼠CD68多克隆抗體1∶200和兔抗大鼠CD163多克隆抗體1∶100），4℃孵育過夜；PBS 清洗后加入熒光二抗（FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體1∶800），室溫避光孵育2 h；PBS清洗后，加入淬滅封片劑將爬片封于載玻片上。于熒光顯微鏡下觀察拍照。③吞噬實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)24 h后的KCs培養(yǎng)液換為0.5%碳素墨水RPMI 1640完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)6 h，PBS洗2次，鏡下觀察細(xì)胞吞噬情況。

1.2.2 .3 鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)動態(tài) 觀察KCs的細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞獲得量及活細(xì)胞率鑒定

KCs的獲得量為9.8×106個/鼠肝，其中活細(xì)胞率占93%以上。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

剛分離出的KCs呈小球狀，折光性極強(qiáng)，直徑約10～12 μm，懸浮于培養(yǎng)液中；3 h后開始貼壁；靜置24 h后胞質(zhì)開始伸出突起，貼壁較牢；48 h后，可見部分細(xì)胞呈多角形。

2.3 熒光顯微鏡觀察

在328 nm波長的激發(fā)光下觀察，未現(xiàn)自發(fā)熒光現(xiàn)象。

2.4 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)

特異性免疫熒光抗體CD68和CD163可結(jié)合到KCs的膜表面受體，CD68和CD163陽性細(xì)胞為綠色，提示優(yōu)先貼壁的細(xì)胞主要為KCs。結(jié)果見圖1。

2.5 吞噬實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)6 h后，PBS洗2次，鏡下可觀察到大多數(shù)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒，細(xì)胞核無明顯變化。結(jié)果見圖1。

3 討論

圖1 大鼠KCs免疫熒光染色及吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果

目前文獻(xiàn)報道Kupffer細(xì)胞的分離純化方法較為復(fù)雜，有離心淘洗法［2］、密度梯度離心法［3-4］、流式細(xì)胞術(shù)［5］等，除本實(shí)驗(yàn)采用的密度梯度離心法外，其他方法對實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求較高，不具有普遍適用性。我們采用了膠原酶消化結(jié)合密度梯度離心法獲得了純度較高的原代肝Kupffer細(xì)胞。

本方法有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢：①腹主動脈取血：在不影響KCs獲得量的同時，能夠?qū)ν粚?shí)驗(yàn)動物進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)檢測。②膠原酶的用量較少：以往的文獻(xiàn)報道中膠原酶用量大，最常見的是0.5 mg/mL的Ⅳ型膠原酶液，總量在50 mg～100 mg，而本實(shí)驗(yàn)中使用的是0.2 mg/mL的Ⅳ型膠原酶液，整個過程中總量不超過30 mg。在細(xì)胞的獲得率和活力沒有降低的基礎(chǔ)上，這種方法大大減少了膠原酶的用量，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)開支。③在體灌注：文獻(xiàn)中大多使用離體循環(huán)灌注法，但在操作過程中很容易因移動導(dǎo)致門靜脈插管脫落或者門靜脈破裂，并且灌注液因循環(huán)利用會導(dǎo)致其pH值變化以及酶活性的變化，影響細(xì)胞的環(huán)境及細(xì)胞活性。而本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用在體灌注法，避免了以上缺陷，且灌注充分，節(jié)省時間。④使用PE導(dǎo)管：課題組在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用一次性輸液針頭穿刺門靜脈，經(jīng)常會出現(xiàn)門靜脈穿透或脫落、針頭與門靜脈結(jié)扎口因灌注壓力大液體滲出嚴(yán)重等現(xiàn)象，改進(jìn)使用PE導(dǎo)管后基本杜絕了這些現(xiàn)象。

本課題組實(shí)驗(yàn)過程中摸索出來的心得體會：①一定要用肝素鈉抗凝，以防實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)凝血而灌注失敗。有文獻(xiàn)采用門靜脈注射法，本課題組采用腹腔注射法是考慮到肝素鈉直接進(jìn)入血管作用太強(qiáng)，避免手術(shù)中出現(xiàn)微血管破裂，不易止血而影響手術(shù)視野和灌注效果。②Ⅳ膠原酶灌注液一定要預(yù)熱到37℃，既能保證酶的活性又能夠保證細(xì)胞所處的環(huán)境溫度最接近在體溫度。③膠原酶的灌注消化時間應(yīng)該嚴(yán)格控制在30 min～40 min，避免因時間過長或過短而減少KCs的獲得量及降低細(xì)胞活性。④控制一定的灌注速率，前灌注液D-hanks主要用于去除肝臟中的血細(xì)胞和肝細(xì)胞間質(zhì)的鈣離子，以利于肝細(xì)胞分離，速率控制在15 mL/min左右；而膠原酶灌注的速率則控制在10 mL/min左右，太快會導(dǎo)致消化不完全，若延長時間則浪費(fèi)Ⅳ型膠原酶。⑤第一次離心是為了避免懸液中Ⅳ型膠原酶進(jìn)一步消化KCs從而影響其活力。⑥加Percoll分離液時，事先用胎牛血清潤滑管壁，使加入后分層更明顯，且減少了離心中管壁對細(xì)胞沉降的影響。

綜上所述，我們經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，改良的方法成功有效地從大鼠肝臟中提取KC，細(xì)胞的獲得量、活性及純度都能保障后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，經(jīng)濟(jì)有效、簡便可行。