馮婷婷，嚴(yán)佳佳

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619； 2.山西振東制藥有限公司，山西晉中030619）

苦參作為傳統(tǒng)中藥，味苦、性寒，具有清熱、解毒、利尿、祛風(fēng)、殺蟲(chóng)作用［1-2］。其主要成分苦參堿在抗菌、抗炎、抗過(guò)敏、抗心律失常、消腫利尿、免疫及生物調(diào)節(jié)等方面有明顯的藥理作用［3］。近年來(lái)還有報(bào)道其有較強(qiáng)的抗腫瘤活性作用［4-5］，對(duì)黑色素瘤、胃癌、膀胱癌、上皮性卵巢癌和乳腺癌等都有不同程度的抑制作用［6-10］。目前對(duì)苦參堿的結(jié)構(gòu)修飾主要以槐果堿的研究最多（其原因?yàn)榛惫麎A可修飾的活性位點(diǎn)較多，易于進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾）［11］，而直接以苦參堿為母體進(jìn)行修飾的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)將苦參堿水解、酯化，然后在無(wú)水四氫呋喃溶液中，氫化鈉作用下，與芳香醛縮合生成相應(yīng)的產(chǎn)物，并通過(guò)細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制作用。對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，我們得到了一個(gè)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物（見(jiàn)圖1）。以苦參堿做對(duì)照，在相同條件下，將得到的苦參堿衍生物作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞，結(jié)果表明其對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的增殖抑制作用。本文在苦參堿修飾和抗腫瘤方面為研究者提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 苦參堿衍生物的合成路線

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker 400MHz超導(dǎo)核磁共振儀，LCQ ACL離子肼液質(zhì)聯(lián)用儀，Nicolet系列傅立葉變換紅外光譜儀，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞容生化儀器廠），SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，85-2型控溫磁力攪拌器；苦參堿（陜西天之潤(rùn)生物科技有限公司），苯甲醛（天津登豐化學(xué)品有限公司），對(duì)氟苯甲醛（薩恩化學(xué)科技有限公司），氫化鈉（華北地區(qū)特種試劑開(kāi)發(fā)中心，分析純），無(wú)水四氫呋喃（阿拉丁試劑），氫氧化鈉（天津登豐化學(xué)品有限公司，分析純），濃鹽酸（天津登豐化學(xué)品有限公司，分析純），人胃癌SGC-7901細(xì)胞株（上海細(xì)胞庫(kù)），F(xiàn)BS胎牛血清（Hyclone），細(xì)胞培養(yǎng)液（Gibco），噻唑藍(lán)（Sigma），DMSO（Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 苦參堿水解 在250 mL單口瓶中加入5 g（0.020 1 mol）苦參堿，50 mL 甲醇，20 mL 水，50 mL氫氧化鈉飽和溶液。加熱至110℃，攪拌回流10 h。冷卻后，調(diào)pH至7～8，旋干，固體分別用氯仿、無(wú)水甲醇洗滌3次除去未反應(yīng)的苦參堿，得到苦參酸鈉鹽與NaCl的混合物。

1.2.2 苦參酸酯化 在250 mL三口圓底燒瓶中加入30 mL二氯亞砜，冰浴下用恒壓滴液漏斗緩慢滴加無(wú)水甲醇20 mL，冰浴下攪拌0.5 h，然后緩慢滴加含有3 g苦參酸鈉鹽與NaCl混合物的無(wú)水甲醇溶液50 mL。滴加完畢，移除冰浴，加熱至60℃，反應(yīng)6 h。冷卻，冰浴下調(diào)pH為7，旋干溶劑，加入無(wú)水甲醇，過(guò)濾除去NaCl，用石油醚洗滌，除去苦參堿。得到純的苦參酸甲酯，產(chǎn)率65.1%。

1.2.3 苦參酸甲酯與苯甲醛縮合［8-9］在100 mL三口圓底燒瓶中加入0.050 g（1 mmol）苦參酸甲酯，0.120 g（5 mmol）氫化鈉，15 mL 無(wú)水四氫呋喃，60 ℃攪拌反應(yīng)1 h，緩慢加入0.530 g（5 mmol）苯甲醛，TLC監(jiān)測(cè)，至苦參酸甲酯完全反應(yīng)，停止反應(yīng)，冷卻，用冷無(wú)水乙醇猝滅氫化鈉，旋干溶劑，加入氯仿溶解，以氯仿/甲醇（1∶1，v/v）做洗脫液，用硅膠柱（200～300目）過(guò)濾，得0.037 g黃色油狀物a。

1.2.4 苦參酸甲酯與對(duì)氟苯甲醛縮合［8-9］在100 mL三口圓底燒瓶中加入 0.050 g（1 mmol）苦參酸甲酯，0.120 g（5 mmol）氫化鈉，15 mL 無(wú)水四氫呋喃，60 ℃攪拌反應(yīng) 1 h，緩慢加入 0.530 g（5 mmol）對(duì)氟苯甲醛，TLC監(jiān)測(cè)，至苦參酸甲酯完全反應(yīng)，停止反應(yīng)后，冷卻，用冷得無(wú)水乙醇猝滅氫化鈉，旋干溶劑，加入氯仿溶解，以氯仿/甲醇（6∶1，v/v）做洗脫液，用硅膠柱（200～300目）過(guò)濾，得0.018 g黃色油狀物b。

1.2.5 苦參堿衍生物1的合成［8-9］在100 mL三口圓底燒瓶中加入 0.280 g（1 mmol）苦參酸甲酯，0.120 g（5 mmol）氫化鈉，15 mL無(wú)水四氫呋喃，60℃攪拌反應(yīng)1 h，TLC監(jiān)測(cè)，至苦參酸甲酯完全反應(yīng)，停止反應(yīng)后，冷卻，用冷無(wú)水乙醇猝滅氫化鈉，旋干溶劑，加入氯仿溶解，用硅膠柱（200～300目）過(guò)濾，以氯仿/甲醇（6∶1，v/v）過(guò)濾，得 0.11 g 苦參堿衍生物。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)于玻璃底培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基采用含10%（v/v）胎牛血清的高糖 Dulbecco′s modified eagle media（DMEM）液體培養(yǎng)基，環(huán)境溫度為37℃，CO2濃度控制在5%的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1～2 d換液，每3～4 d傳代1次，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取含1.0×106個(gè)/mL密度細(xì)胞懸液200 μL接種于96孔培養(yǎng)板上，在環(huán)境溫度為37℃、CO2濃度為5%以及飽和濕度的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用苦參堿作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)，考察苦參堿衍生物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的殺傷作用。將稀釋為不同濃度的藥液（100 μM、200 μM、400 μM、800 μM）分別加入到各孔中，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)只加細(xì)胞不加藥液的對(duì)照孔，只加DMSO溶劑的空白孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液（5 g/L）20 μL，孵育4 h停止培養(yǎng)，1 500 rpm離心10 min，小心地棄去上清，每孔加DMSO150 μL，振蕩5 min，用免疫酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)570 nm）比色。根據(jù)測(cè)得的OD值計(jì)算細(xì)胞的存活率。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿衍生物1

通過(guò)質(zhì)譜、氫譜、碳譜、紅外確證苦參酸甲酯分別與苯甲醛、對(duì)氟苯甲醛縮合，生成相應(yīng)的產(chǎn)物a和b，與回流苦參酸甲酯的產(chǎn)物一致，均為苦參堿衍生物 1。元素分析，計(jì)算值（%）：C，72.54；H，9.74；N，11.28；實(shí)測(cè)值：C，72.51；H，9.79；N，11.22.ES-MS（CH3OH，m/z）：519.0［M+Na］+）.IR（KBr）（νmax/cm-）1：3420，2930，2850，2020，1732，1601，1523，1514，1491，1450，1423，1382，1314，1235，1181，1147，882，801，651.1H NMR （400 MHz，CDCl3）：4.68（s，4H），4.52（d，2H），4.10（s，2H），3.77（s，1H），3.28（br m，4H），2.44-2.48（br m，4H），2.23-2.28（m，4H），2.15 （t，4H），2.01（d，4H），1.90（s，4H），1.79（br m，5H），1.48-1.76 （br m，4H），1.39-1.42（q，3H），1.26（s，2H），0.90（s，1H）.13C NMR（400 MHz，CDCl3）：169.71，128.74，115.31，64.37，56.69，32.69，27.25，18.16。

2.2 苦參堿衍生物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用

以苦參堿作為對(duì)照，將得到的苦參堿衍生物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用進(jìn)行研究。結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可知，在實(shí)驗(yàn)濃度下（≤800 μM），苦參堿沒(méi)有明顯的細(xì)胞增殖抑制作用，而苦參堿衍生物效果較為明顯，在濃度為200 μM時(shí)已呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。相同濃度下，苦參堿衍生物的效果優(yōu)于苦參堿，且隨著濃度的增加，其細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)。

圖2 苦參堿、苦參堿衍生物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用比較

3 討 論

3.1 苦參堿衍生物1的合成

苦參堿水解得到苦參酸鈉鹽后，用水將苦參酸鈉鹽溶解，稀鹽酸調(diào)pH值為5～6，TLC監(jiān)測(cè)，顯示部分苦參酸鈉鹽轉(zhuǎn)化為苦參堿，過(guò)柱得到產(chǎn)物產(chǎn)率太低，且浪費(fèi)溶劑。將苦參酸鈉鹽直接酯化，反應(yīng)過(guò)程中也有苦參堿生成，在硅膠柱分離過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)始終有苦參堿交叉點(diǎn)出現(xiàn)，且產(chǎn)物越來(lái)越少，多次驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)苦參酯在過(guò)柱過(guò)程中水解，轉(zhuǎn)化為苦參堿。最后采用洗滌的方法除去苦參堿，得到苦參酸甲酯，其方法為：用乙醚洗滌效果最好，但乙醚較貴，回收損失太大，最終選擇石油醚洗滌，效果較佳。

本實(shí)驗(yàn)最后一步初期思路是在無(wú)水四氫呋喃溶液中，氫化鈉作用下，苦參酸甲酯分別與苯甲醛、對(duì)氟苯甲醛縮合，生成相應(yīng)的產(chǎn)物，如圖1。在反應(yīng)過(guò)程中，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，當(dāng)苦參酸甲酯反應(yīng)完全后，停止反應(yīng)，過(guò)柱分離得到產(chǎn)物，通過(guò)質(zhì)譜、氫譜、碳譜、紅外確證苦參酸甲酯與苯甲醛、對(duì)氟苯甲醛反應(yīng)的產(chǎn)物一致。于是另設(shè)反應(yīng)：在無(wú)水四氫呋喃溶液中，氫化鈉作用下，回流苦參酸甲酯，得到目標(biāo)化合物，通過(guò)質(zhì)譜、氫譜、碳譜、紅外確證其產(chǎn)物與回流苦參酸甲酯與苯甲醛和對(duì)氟苯甲醛反應(yīng)的產(chǎn)物一致，均為苦參堿衍生物1。推測(cè)其機(jī)制可能為：苦參酸甲酯首先在氫化鈉作用下，發(fā)生酯的氨解，生成苦參堿，苦參堿與苦參酸甲酯在氫化鈉作用下，生成苦參堿衍生物1。

3.2 苦參堿衍生物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用

近年來(lái)，苦參堿和氧化苦參堿在抗腫瘤方面有較多的研究，在臨床上作為抗癌的輔助藥物也得到了廣泛的應(yīng)用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到，在低濃度下，我們修飾過(guò)的苦參堿衍生物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖表現(xiàn)出了良好的抑制作用。我們通過(guò)對(duì)苦參堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，提高了其抗癌活性，本文在苦參堿修飾和抗腫瘤方面為研究者提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，本文合成了一種新的苦參堿衍生物，該物質(zhì)對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖有抑制作用，可以作為抗癌輔助藥物。