方志華 ，梁君偉 ，呂喜英 △

（1.河北省承德市第三醫(yī)院，河北 承德 067000； 2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000）

目前，乳腺癌占惡性腫瘤的7%～10%，已成為威脅人類健康的惡性疾病，且發(fā)病率還在不斷攀升[1－2]。有研究顯示，糖尿病能增加患乳腺癌的風險，且與其預(yù)后相關(guān)[3－4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病經(jīng)常與癌癥同時存在，如合并乳腺癌[5]。在治療乳腺癌的同時控制好血糖可獲得較好的預(yù)后。流行病學研究表明，臨床常用的一線降糖藥物二甲雙胍可降低乳腺癌發(fā)病率，并對改善乳腺癌患者的預(yù)后有一定作用[6－7]。Bruderer等[8]研究發(fā)現(xiàn)，長期使用二甲雙胍治療糖尿病的女性患者患乳腺癌的風險會降低。體外研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可減少荷瘤裸鼠腫瘤的體積和抑制人乳腺癌細胞MCF－7增殖[9]。格列美脲為臨床常用的第3代磺酰脲類抗糖尿病藥物，常用于治療2型糖尿病，但其是否也像二甲雙胍一樣具有治療乳腺癌的作用，目前研究較少。降糖藥物治療癌癥的機制目前并不清楚，研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)源性非編碼RNAs，在真核生物中存在，參與細胞分化、細胞增殖和凋亡等各種過程，與腫瘤密切相關(guān)，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程[10]。miRNA－214是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，也具有調(diào)節(jié)細胞生長、分化和凋亡的作用，在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌等癌組織中表達上調(diào)[11]。因此，本研究中通過研究格列美脲對人乳腺癌細胞MCF－7增殖的影響，檢測miRNA－214的表達情況，從miRNA水平探討格列美脲治療乳腺癌可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株、試藥與儀器

細胞株與試藥：人乳腺癌細胞MCF－7（西安賽拓博泰生物公司，編號CM－1250）。格列美脲分散片（石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，國藥準字H20100182，規(guī)格為每片2 mg），用無血清RPMI－1640培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，規(guī)格為每瓶 500 mL，貨號11965－092）配制成質(zhì)量濃度為1 g／L的貯備液，過濾除菌，分裝，－20℃保存?zhèn)溆?，使用培養(yǎng)基稀釋到所需質(zhì)量濃度。

試劑：胎牛血清（江蘇匯達醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格為 每 瓶 100 mL，貨 號 10099－141）；PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海碧云天公司，貨號 DRR037A，可用200次）；SYBR Premix Ex Taq TMⅡ熒光定量PCR試劑盒（上海碧云天公司，貨號 HZ－F360，可用 100 次）；ANNEXIN VFITC／PI凋亡檢測試劑盒（上海碧云天公司，貨號CA1020，可用 50 次）；miRNA －214，Bax，Bcl－2，Caspase－3引物（大連 TaKaRa＜中國＞公司）；Trizol Reagent RNA提取試劑盒（美國Invitrogen公司，規(guī)格為100 mL，貨號 15596 －026）；MTT（美國 Amresco公司，貨號M5655，可用50次）。

儀器：BIO－RAD型垂直電泳儀（美國BD公司）；倒置顯微鏡（特瑞歐奧林巴斯公司）；高速低溫離心機（上海浦東天本離心機公司）；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（蘇達實驗儀器有限公司）；電泳儀、電轉(zhuǎn)移槽及電源、凝膠成像分析系統(tǒng)（北京六一儀器廠）；流式細胞儀（美國BD FACSCalibur公司）；逆轉(zhuǎn)錄儀（杭州博日科技有限公司）；Real Time PCR儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組

用含10%小牛血清的 RPMI－1640培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2，飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)人乳腺癌細胞MCF－7。當MCF－7細胞處于對數(shù)生長期時進行試驗，分為空白對照組及格列美脲低、中、高劑量組?？瞻讓φ战M在接種后待細胞生長到融合狀態(tài)，正常培養(yǎng)48 h，格列美脲低、中、高劑量組接種后待細胞生長到融合狀態(tài)，分別給予終質(zhì)量濃度為10，20，40μg／mL的格列美脲，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲細胞，進行相關(guān)檢測。

1.2.2 MTT法檢測細胞存活率

選擇對數(shù)生長期MCF－7細胞，消化后調(diào)整細胞濃度，以 5×103／孔接種于 96孔板，200μL／孔，待細胞融合后，棄培養(yǎng)基，依次加入終質(zhì)量濃度分別為0，5，10，20，40，60，80μg／mL 的格列美脲 RPMI－1640培養(yǎng)基，200 μL ／孔，培養(yǎng) 48 h，加入 MTT，50 μL ／孔。培養(yǎng) 4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO），200 μL ／孔，振蕩10 min，用檢測的吸光度（OD）值，計算MCF－7細胞的存活率。每個劑量組設(shè)6個平行樣。

1.2.3 實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）法檢測miRNA －214，Bax，Bcl－2和 Caspase－3 mRNA 表達

按照細胞培養(yǎng)項下方法處理細胞，消化后根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明書進行總RNA提取，并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq TMⅡ熒光定量PCR試劑盒說明，制備20μL反應(yīng)體系，在CFX－96 PCR擴增儀中進行擴增。反應(yīng)條件為預(yù)變性 95 ℃ 30 s，變性 95 ℃ 5 s，60 ℃ 44 s，40 個循環(huán)，采集數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

1.2.4 細胞凋亡檢測

按照細胞培養(yǎng)項下方法處理細胞，消化后測定MCF－7細胞凋亡率。每孔5×105個細胞，每個劑量組設(shè)5個平行樣。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

結(jié)果見表1至表4、圖1和圖2。

表1 格列美脲對MCF－7細胞增殖的影響（±s）

表1 格列美脲對MCF－7細胞增殖的影響（±s）

注：與 0μg／mL比較，F(xiàn) ＝8.52，a P ＜0.05。

質(zhì)量濃度（μg／mL）0 5 10 20 40 60 80作用時間（h）48 48 48 48 48 48 48細胞增殖率（%）96.42±9.73 89.45±4.50 72.34±6.47a 54.22±5.41a 46.28±12.84a 36.54±6.28a 21.27±11.67a

3 討論

miRNA是一種非編碼單鏈小分子RNA，能以堿基互補的形式結(jié)合到靶基因的非編碼區(qū)，轉(zhuǎn)錄后 基因進行負調(diào)控。其存在于人體外周血，且在血液中穩(wěn)定而持續(xù)地表達，結(jié)果具有可重復(fù)性，參與了多種細胞的進程（細胞增殖、分化、凋亡等）[12]。在人類腫瘤發(fā)生的變異區(qū)域內(nèi)約50%檢測到miRNA基因，提示miRNA可能

與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，由 miRNA表達譜異常引起的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與許多腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如乳腺癌、胃癌、小細胞肺癌和肝癌等[14]。在癌組織中，一些miRNA會特異表達增高或降低，如miRNA－155，miRNA－10b，miRNA－21等常過度表達，而miRNA－214，miRNA－518b，miRNA－17p，miRNA－126，miRNA－335，miRNA －205等則表達下調(diào)，從而促進腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。miRNA在細胞或組織中具有特異性，故miRNA在疾病的診斷和治療中有廣闊前景。

表2 格列美脲對人乳腺癌細胞MCF－7 miRNA－214和Caspase－3 mRNA表達的影響（±s）

表2 格列美脲對人乳腺癌細胞MCF－7 miRNA－214和Caspase－3 mRNA表達的影響（±s）

注：與空白對照組比較，F(xiàn)＝12.20，20.41，a P＜0.05，b P＜0.05。

組別空白對照組低劑量組中劑量組高劑量組作用時間（h）48 48 48 48總RNA（ng／μL）31.24±2.48 35.12±5.71 32.70±4.75 30.78±5.74 miRNA－214 1.00±0.08 0.91±0.17 0.64±0.16a 0.49±0.13a Caspase－3 1.00±0.10 1.15±0.21 1.61±0.24b 1.89±0.15b

表3 格列美脲對人乳腺癌細胞MCF－7 Bax和Bcl－2 mRNA表達的影響（±s）

表3 格列美脲對人乳腺癌細胞MCF－7 Bax和Bcl－2 mRNA表達的影響（±s）

注：與空白對照組比較，a P＜0.05。

組別空白對照組低劑量組中劑量組高劑量組作用時間（h）48 48 48 48 Bax 1.00±0.09 1.43±0.11a 1.82±0.17a 2.05±0.14a Bcl－2 1.00±0.12 1.08±0.10 1.27±0.03a 1.29±0.27a Bax ／Bcl－ 2 1.03±0.14 1.36±0.22 1.47±0.09a 1.60±0.14a

表4 格列美脲對人乳腺癌細胞MCF－7細胞凋亡的影響

圖1 人乳腺癌細胞MCF－7 mRNA電泳圖

圖2 格列美脲誘導MCF－7細胞凋亡圖

miRNA－214在多種腫瘤疾病中表達異常，通過調(diào)控不同靶基因，調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡[16]。miRNA－214在乳腺癌、肝癌、宮頸癌、骨髓瘤等疾病中表達降低[17]。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細胞凋亡受到抑制時，miRNA－214的表達增加，可通過抑制抑癌基因PTEN的表達而抑制腫瘤細胞的凋亡[18]。細胞凋亡為程序性細胞死亡，在機體間維持動態(tài)平衡。當機體間這種平衡被打破，就會引發(fā)多種疾病，細胞增殖失控與細胞凋亡失常，從而導致腫瘤。同時，誘導腫瘤細胞凋亡也為腫瘤的治療提供了一個新的方向[19]。B 淋巴細胞瘤－2（B－cell lymphoma－2，Bcl－2）家族參與了細胞凋亡的調(diào)控，主要分為促進細胞凋亡（Bax，Bad）、抑制細胞凋亡（Bcl－2、Bclxl）和 BH3－only 蛋白（Bim，Bid，DP5）3 個家族[20]。Bcl－2家族相關(guān)蛋白主要分布于細胞器膜上。當受到促進凋亡的藥物作用時，Bcl－2表達則受到抑制，Bax表達升高，使線粒體膜電位發(fā)生改變，使膜通道開放，細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中，誘導凋亡小體形成，從而激活Caspase家族，最終導致細胞凋亡。Bax／Bcl－2是一個較靈敏的指標，其增高決定了細胞進入凋亡的執(zhí)行期。Caspase家族是細胞凋亡執(zhí)行者，被激活后將引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，凋亡啟動因子（Caspase－2，Caspase－9等）發(fā)生活化，并激活下游凋亡執(zhí)行因子（Caspase－3，Caspase－6，Caspase－7 等），尤其是 Caspase－3的激活，表示細胞凋亡進入不可逆階段，最終導致細胞進入凋亡階段[21]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，格列美脲能抑制人乳腺癌細胞MCF－7細胞增殖，通過下調(diào)MCF－7細胞中miRNA－214 mRNA的表達，啟動細胞凋亡程序，使Caspase－3，Bax，Bcl－2 mRNA 表達增加，Bax／Bcl－2 增高，從而促進MCF－7細胞凋亡，為格列美脲抑制乳腺癌細胞生長提供一定的理論依據(jù)。