曾憲海，焦云飛，廖子榮，潘登浪，林位夫

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州油棕種質(zhì)資源圃，海南 儋州 571737；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070；3.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 海口 570228）

油棕是典型的熱帶植物，適宜生長(zhǎng)溫度為22～33℃［1］，我國(guó)熱區(qū)地處熱帶北緣，風(fēng)、寒、旱等自然災(zāi)害時(shí)有發(fā)生，其中低溫寒害往往給熱作生產(chǎn)造成重大損失［2］。油棕的抗寒能力存在個(gè)體差異且因品種而異［3］，具有明顯的生態(tài)型特點(diǎn)，是油棕遺傳適應(yīng)性對(duì)生態(tài)環(huán)境表現(xiàn)出的適應(yīng)能力的差異所致，不但表現(xiàn)在生長(zhǎng)上，也表現(xiàn)在其高產(chǎn)特性上。前期廣東引種調(diào)查發(fā)現(xiàn)了一些油棕植株無(wú)明顯寒害癥狀且能正常生長(zhǎng)結(jié)果，這些優(yōu)株在當(dāng)?shù)亟?jīng)過(guò)了長(zhǎng)期的自然馴化，有可能存在重大的有益變異［4］。因此，評(píng)價(jià)、挖掘與利用這些優(yōu)株對(duì)發(fā)展我國(guó)油棕產(chǎn)業(yè)具有重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)外油棕抗寒性研究主要集中在田間寒害調(diào)查、組織形態(tài)觀察、生理生化和分子生物學(xué)評(píng)價(jià)等方面［3，5］，其中應(yīng)用電導(dǎo)率及Logistic方程比較植物組織的低溫半致死溫度（LT50）能較為準(zhǔn)確地鑒定植物抗寒性并取得比較一致的結(jié)果［6-8］。葉片是植物對(duì)低溫脅迫最敏感的器官之一，葉片的解剖結(jié)構(gòu)對(duì)不同環(huán)境條件具有響應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制，是評(píng)價(jià)林木抗寒性的重要指標(biāo)［9］。Luis等［10］比較了溫室和試管培養(yǎng)條件下油棕實(shí)生幼苗的葉片解剖結(jié)構(gòu)差異，發(fā)現(xiàn)兩種生長(zhǎng)環(huán)境條件下葉片組織結(jié)構(gòu)的基本組成相同，但溫室苗的表皮細(xì)胞和角質(zhì)層比試管苗的厚且中脈較粗。曹紅星等［11］研究了油棕實(shí)生幼苗的葉片在不同低溫處理下解剖結(jié)構(gòu)的差異，認(rèn)為葉片總厚度和細(xì)胞組織疏松度在不同低溫處理下變化明顯，可作為油棕抗寒種質(zhì)鑒定的結(jié)構(gòu)指標(biāo)。阮志平［12］研究認(rèn)為，布迪椰子、沼地棕和油棕的抗寒性差異與葉片是否分化出柵欄組織和海綿組織有顯著相關(guān)性，同時(shí)，具有薄的角質(zhì)層和上柵欄組織，且柵欄組織細(xì)胞較長(zhǎng)、細(xì)胞排列疏松與油棕的弱抗寒性有一定的關(guān)系。劉蕊等［13］通過(guò)對(duì)5個(gè)椰子品種植株一年生幼苗的葉片解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，認(rèn)為柵欄組織厚度、葉片總厚度、上（下）角質(zhì)層厚度、上（下）表皮厚度和海綿組織厚度均可作為抗寒性鑒定的參考指標(biāo)。本研究在前期調(diào)查基礎(chǔ)上，對(duì)引種廣東深圳、東莞、茂名、化州、湛江和雷州6個(gè)地區(qū)的油棕居群共38株油棕大樹進(jìn)行了葉片解剖結(jié)構(gòu)和低溫半致死溫度的觀測(cè)和比較分析，旨在為進(jìn)一步篩選利用抗寒高產(chǎn)油棕種質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以從海南引種廣東深圳市區(qū)（114°01′E、22°32′N，以下簡(jiǎn)稱深圳）、東莞植物園（113°44′E、22°58′N，以下簡(jiǎn)稱東莞）、茂名市區(qū)（110°56′E、21°39′N，以下簡(jiǎn)稱茂名）、化州廣東農(nóng)墾熱作所（110°30′E、21°38′N，以下簡(jiǎn)稱化州）、湛江市區(qū)（110°24′E、21°12′N，以下簡(jiǎn)稱湛江）和雷州市區(qū)（110°05′E、20°54′N，以下簡(jiǎn)稱雷州）6個(gè)地區(qū)（居群）中的38株油棕大樹為研究對(duì)象，其中深圳12株（株號(hào)為SZ1～SZ12）、東 莞 2株（ 株 號(hào) 為 DG1～DG2）、 茂 名 8株（株號(hào)為MM1～MM2）、化州8株（株號(hào)為HZ1～HZ8）、湛江 5株（株號(hào)為 ZJ1～ZJ5）、雷州3株（株號(hào)為L(zhǎng)Z1～LZ3）。油棕的具體地理分布信息可參考Zeng等［8］的報(bào)道。葉片解剖結(jié)構(gòu)特征觀察所需材料于2014年4月初采集油棕樹冠向陽(yáng)面中部健康葉片（約第17片葉）葉軸中間兩邊的小葉各3～4片，于每片小葉中間處剪取寬1～2 cm的葉片材料進(jìn)行FAA液固定處理24 h以上。選取其中4個(gè)葉樣做成石蠟，每個(gè)石蠟制片9～12個(gè)，選取4個(gè)較好的切片進(jìn)行觀察。LT50測(cè)定所需材料于2014年4月初晴天下午采集油棕葉片樣品，按單株采集，每株3份葉樣，葉樣選取約第17片葉葉軸中部?jī)蛇呅∪~，用長(zhǎng)柄拉刀緊靠葉軸中部快速割斷小葉，選取健康、完整小葉若干，將小葉葉柄切口處用濕潤(rùn)沙布包裹，然后放入塑料袋（平放20 cm×35 cm），封口并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察 參照李正理的植物葉片石蠟切片法［14］并進(jìn)行適當(dāng)改良，具體步驟包括取材與固定、洗滌與脫水、透明、浸蠟、包埋和修蠟、切片、展片和粘片、脫蠟和染色、封片處理。采用Leica DMLB研究用生物顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察并用Leica DFC500數(shù)字圖象照相機(jī)進(jìn)行拍照，采用ImageJ軟件測(cè)量葉片總厚度（LT）、葉肉細(xì)胞厚度（MCT）、柵欄組織（PT）和海綿組織厚度（ST）、上角質(zhì)層（DCT）和下角質(zhì)層厚度（BCT）、上表皮層（DET）和下表皮層（BET）厚度、上內(nèi)皮層（DHT）和下內(nèi)皮層（BHT）厚度以及中脈維管束長(zhǎng)度（MVBL）和寬度（MVBW），以上指標(biāo)單位均為微米（μm），并計(jì)算細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（CTR，%）、細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度（CSR，%）和柵欄組織厚度與海綿組織厚度比（P/S，柵海比）。葉片中脈維管束的厚度選擇中脈中較大的5個(gè)維管束進(jìn)行測(cè)量并以中脈維管束的長(zhǎng)度（與表皮垂直方向）和寬度（與表皮平行方向）來(lái)對(duì)其厚度進(jìn)行描述。每份樣品觀測(cè)4個(gè)切片，每個(gè)切片每個(gè)指標(biāo)取10個(gè)視野測(cè)量。

1.2.2 LT50測(cè)定 參照曾憲海等［7］的方法，油棕植株LT50（單位為℃）的測(cè)定數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值，油棕居群的數(shù)據(jù)均為所在居群全部植株測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.3 方差分析、表型相關(guān)性分析和通徑分析 6個(gè)居群共38株油棕植株的15個(gè)葉片解剖結(jié)構(gòu)特征參數(shù)與油棕居群和植株的LT50觀測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、表型相關(guān)分析和通徑分析，其中通徑分析參照曾憲海等［7］的方法，以分析決定性狀之間的內(nèi)在關(guān)系。本研究為闡明油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)特征對(duì)油棕抗寒力的影響，以LT50為自變量、葉片解剖結(jié)構(gòu)特征為因變量，考察因變量和自變量之間的因果關(guān)系。一個(gè)性狀j對(duì)因變量（y）的直接影響（p）是通過(guò)一個(gè)單方向路徑揭示的，對(duì)因變量的直接影響用pij表示；而其間接影響是通過(guò)交互路徑揭示的，即一個(gè)性狀i對(duì)因變量（y）的影響是經(jīng)由另一個(gè)性狀j來(lái)實(shí)現(xiàn)，性狀ij的相關(guān)系數(shù)用rij表示，i≠j對(duì)因變量的間接影響用rijpjy表示。

利用Excel軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析、表型相關(guān)性分析和通徑分析［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)的基本特征

油棕葉片上、下表皮細(xì)胞層數(shù)均為1層，表面均覆蓋著一層角質(zhì)層，且上、下表皮細(xì)胞中均有氣孔結(jié)構(gòu)；上、下內(nèi)皮層細(xì)胞分別位于上、下表皮細(xì)胞的下方，呈無(wú)色且比表皮細(xì)胞大，細(xì)胞層數(shù)絕大部分為2層；葉肉由柵欄組織和海綿組織組成，柵欄組織無(wú)分化，僅有下柵欄組織，柵欄組織細(xì)胞層數(shù)大部分為2～3層，而海綿組織為4～6層，均為等徑形狀的薄壁細(xì)胞組成，屬同質(zhì)綠色組織，細(xì)胞間隙?。▓D1，封二）。葉片中脈維管束數(shù)量4～12個(gè)，為外韌型維管束（木質(zhì)部在葉背面、韌皮部在葉腹面），內(nèi)含原生木質(zhì)部、后生木質(zhì)部、韌皮部和厚壁組織，并形成一個(gè)密集的厚壁組織鞘，其中較大的中脈維管束含多個(gè)獨(dú)立韌皮部。中脈維管束排列形式多樣，其中以卵形、菱形和五邊形居多（圖2，封二）。

2.2 油棕植株和居群的葉片解剖結(jié)構(gòu)及其抗寒力的差異比較分析

油棕的15個(gè)葉片解剖結(jié)構(gòu)特征參數(shù)以及LT50在38株植株個(gè)體之間均存在極顯著差異（表1）。深圳居群中的SZ3植株葉片的上內(nèi)皮層和下表皮層厚度最小，SZ5的上角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度、下內(nèi)皮層厚度、葉肉細(xì)胞厚度、細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度、柵海比和最大的細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度最小，SZ6的海綿組織厚度和細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度最小，SZ7的葉片總厚度最小，SZ8的中脈維管束長(zhǎng)度最小。HZ5的下角質(zhì)層厚度最小，HZ6的中脈維管束寬度最小，HZ2則以

上表皮層厚度最小、上皮內(nèi)層厚度最大。MM2的海綿組織厚度和下角質(zhì)層厚度最大，而細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度和柵海比則以MM3最大，此外，MM4、MM6和MM7以下表皮層厚度、上表皮層厚度和下內(nèi)皮層厚度最大。ZJ4的柵欄組織厚度、葉肉細(xì)胞厚度和葉片總厚度最大，而ZJ5中脈維管束寬度最大，LZ3則以上角質(zhì)層厚度和中脈維管束長(zhǎng)度最大。植株LT50以SZ1為最大（-2.69℃）、SZ7最?。?6.19℃）。在6個(gè)油棕居群的15個(gè)葉片解剖結(jié)構(gòu)特征參數(shù)中，僅葉片的中脈維管束長(zhǎng)度（P= 0.0856）和細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度（P= 0.3718）在居群之間沒(méi)有顯著差異（表2）。而居群的LT50以雷州居群最大（-3.13℃）、東莞居群最小（-5.44℃）。

表1 油棕植株的葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表2 油棕居群的葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)測(cè)定

2.3 油棕植株和居群的葉片解剖結(jié)構(gòu)與其抗寒力的相關(guān)性分析

相關(guān)系數(shù)越大表明關(guān)系強(qiáng)度越高。Cohen將相關(guān)系數(shù)（r）為 r ≥ 0.70、0.69 ＞r＞ 0.50、0.49 ＞r＞ 0.30和0.29 ＞r≥ 0.10分別評(píng)價(jià)為關(guān)系強(qiáng)度非常高、高、中等和低4個(gè)等級(jí)［16］。相關(guān)分析結(jié)果（表3～表4）表明，無(wú)論是油棕植株還是居群，其葉片的中脈維管束寬度與其他解剖結(jié)構(gòu)特性之間均無(wú)顯著相關(guān)性，居群葉片的上角質(zhì)層厚度、下內(nèi)皮層厚度、下表皮層厚度和中脈維管束長(zhǎng)度與其他葉片解剖結(jié)構(gòu)特性之間也沒(méi)有顯著相關(guān)性。油棕植株和居群的葉片上表皮層厚度與下角質(zhì)層厚度（分別為r= 0.46**和r= 0.93**）和細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（分別為r= 0.41**和r= 0.80*）均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，但居群的相關(guān)性較強(qiáng)；柵欄組織厚度與葉肉細(xì)胞厚度、葉片總厚度、細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度和柵海比均呈非常強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系；海綿組織厚度與葉肉細(xì)胞厚度、葉片總厚度和上內(nèi)皮層厚度呈顯著正相關(guān)關(guān)系；下角質(zhì)層厚度與細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度、柵海比顯著正相關(guān)，但居群的相關(guān)性較強(qiáng)；葉肉細(xì)胞厚度與葉片總厚度、細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度顯著正相關(guān)；細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度與細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度成顯著負(fù)相關(guān)（分別為r= - 0.45**和r= - 0.94**）、與柵海比呈顯著正相關(guān)（分別為r= 0.88**和r= 0.99**）；細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度與柵海比呈顯著負(fù)相關(guān)（分別為r= - 0.79**和r= - 0.97**）。而油棕植株和居群的葉片解剖結(jié)構(gòu)特征與其所對(duì)應(yīng)的植株和居群的林LT50之間均沒(méi)有顯著相關(guān)性。

2.4 影響油棕抗寒力的主要葉片解剖結(jié)構(gòu)因子

以LT50作為抗寒力鑒定指標(biāo)，LT50越小，抗寒力越強(qiáng)。由表5可知，在油棕植株葉片解剖結(jié)構(gòu)特征中，海綿組織厚度對(duì)植株LT50的影響最大且有負(fù)向直接影響（p2y= - 4.0199），其次為柵/海比（p11y= - 2.341），且葉肉細(xì)胞厚度經(jīng)由海綿組織厚度也具有最大的負(fù)向間接影響（r72p2y= - 3.506）；而葉片總厚度有最大的正向直接影響（p8y= 2.6694），其次為細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（p9y=1.369），且葉肉細(xì)胞厚度經(jīng)由葉片總厚度也具有最大的正向間接影響（r78p8y= 2.572）。表明植株葉片的海綿組織厚度和柵/海比越大，植株的LT50越小、抗寒力越強(qiáng)，而葉片總厚度和細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度的影響作用則相反。此外，由于決定系數(shù)（0.27839）偏小、剩余通徑系數(shù)（0.84948）較大，說(shuō)明27.8%的LT50表型變異是由表5中所列的結(jié)構(gòu)因子決定的，但未知因素可能占LT50表型變異的72.2%，表明影響LT50的更重要因素尚未考慮在內(nèi)［17］，因此本研究中的葉片解剖結(jié)構(gòu)特征應(yīng)是油棕植株抗寒力形成的次要因素。

表3 油棕植株抗寒力與葉片解剖結(jié)構(gòu)特征的相關(guān)性分析

表4 油棕居群抗寒力與葉片解剖結(jié)構(gòu)特征的相關(guān)性分析

從表6可以看出，上角質(zhì)層厚度是影響油棕居群LT50的主要決定因子且具有最大的正向直接作用（p1y=1.0149），其次為細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度（p4y=0.648），影響強(qiáng)度最低的為上內(nèi)皮層厚度（p2y=0.230），而細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度經(jīng)由上角質(zhì)層厚度則具有最大的負(fù)向間接影響（r11p1y=-0.463）。維管束長(zhǎng)度具有最大的負(fù)向直接作用，但影響強(qiáng)度低（p3y=-0.149），而維管束長(zhǎng)度經(jīng)由上角質(zhì)層厚度則具有最大的正向間接影響（r31p1y=0.178）。表明較低的上角質(zhì)層厚度和細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度有利于提高油棕居群的抗寒力。

表5 油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)特征對(duì)植株抗寒力的直接（對(duì)角線）和間接（非對(duì)角線）影響

表6 油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)特征對(duì)居群抗寒力的直接（對(duì)角線）和間接（非對(duì)角線）的影響

3 結(jié)論與討論

低溫影響油棕的生長(zhǎng)和產(chǎn)量［3］。低溫脅迫時(shí)，植物細(xì)胞膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，因此，可通過(guò)測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率的大小來(lái)反映植物的抗寒性［6］，這在許多植物上得到了應(yīng)用［18-19］。而葉片是植物進(jìn)化過(guò)程中對(duì)環(huán)境變化較敏感且可塑性較大的器官，其結(jié)構(gòu)特征最能體現(xiàn)環(huán)境因子對(duì)植物生長(zhǎng)的影響或植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)，常被用作植物抗寒性鑒定依據(jù)之一，但因不同植物在解剖結(jié)構(gòu)上的抗寒機(jī)制不同，因此影響植物抗寒力的主要結(jié)構(gòu)因子也不盡一致［20］。Luis等［10］研究發(fā)現(xiàn)溫室和試管生長(zhǎng)條件下的油棕實(shí)生幼苗的葉片解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育存在差異，且較大的葉片角質(zhì)層厚度有利于提高植物的環(huán)境適應(yīng)性。曹紅星等［11］認(rèn)為葉片總厚度和細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度因低溫脅迫時(shí)變化明顯，可作為油棕抗寒種質(zhì)鑒定的結(jié)構(gòu)指標(biāo)。馬婷等［18］在比較不同核桃品種的抗寒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度、海綿組織厚度和葉片總厚度越大，核桃抗寒力越強(qiáng)，認(rèn)為是這評(píng)價(jià)核桃抗寒性的重要指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)油棕植株之間的葉片解剖結(jié)構(gòu)和LT50均存在顯著差異，但葉片中脈維管束長(zhǎng)度和細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度在居群之間則沒(méi)有顯著差異。此外，油棕植株葉片中脈維管束寬度以及居群葉片的上角質(zhì)層厚度、下內(nèi)皮層厚度、下表皮層厚度、中脈維管束長(zhǎng)度和寬度與其他解剖結(jié)構(gòu)沒(méi)有顯著相關(guān)性，且油棕植株和居群的葉片解剖結(jié)構(gòu)與其所對(duì)應(yīng)的LT50均無(wú)顯著相關(guān)性。以LT50為抗寒力鑒定指標(biāo)，LT50越小，抗寒力越強(qiáng)。通徑分析表明，葉片海綿組織厚度是是決定油棕植株抗寒力的主要結(jié)構(gòu)因子（p2y= - 4.0199），海綿組織厚度越大，植株抗寒力越強(qiáng)，但上角質(zhì)層厚度則是對(duì)油棕居群抗寒力起重要決定作用的結(jié)構(gòu)因子（p1y= 1.0149），即較薄的上角質(zhì)層厚度有利于誘導(dǎo)油棕居群抗寒力的增強(qiáng)，依此可分別篩選出MM2（109.99 μm）和SZ6（51.46 μm）為抗寒性最強(qiáng)（-4.62℃）和抗寒性最弱（-5.00℃）植株，深圳（1.79 μm）和湛江（2.46 μm）為抗寒性最強(qiáng)（-4.68℃）和抗旱性最弱（-3.62℃）居群。而篩選的結(jié)果與LT50的實(shí)際測(cè)定結(jié)果不一致，且與其他學(xué)者的研究結(jié)果不盡相同。Luis等［10］認(rèn)為，葉片角質(zhì)層厚度的增加，在植物自身防御與抗逆等方面扮演重要角色，如較厚的角質(zhì)層限制了病原體的侵染，減少了營(yíng)養(yǎng)元素以及其他物質(zhì)的滲出，提高了植物環(huán)境適應(yīng)性。阮志平［12］研究認(rèn)為，油棕葉片的海綿組織厚度、柵欄組織的層數(shù)和厚度、細(xì)胞組織緊密度和疏松度以及柵海比等指標(biāo)都不宜用于鑒定植株抗寒能力，而與柵欄組織分化顯著相關(guān)。蔡永立等［21］研究認(rèn)為，植物葉片的上、下表皮層細(xì)胞厚度、柵欄組織和海綿組織厚度以及葉片總厚度的增加是植物對(duì)低溫環(huán)境的反應(yīng)。王明啟等［22］通過(guò)薔薇屬切片發(fā)現(xiàn)，耐寒品種的柵欄組織厚度較大，而不耐寒品種的海綿組織厚度較大。李劍等［23］認(rèn)為植物葉片解剖結(jié)構(gòu)的細(xì)胞組織緊密度越大、細(xì)胞組織疏松度越小，其抗寒性越強(qiáng)。鑒于植物的抗寒性是一個(gè)復(fù)合性狀，不但存在遺傳差異，也易受到環(huán)境和栽培條件等影響，因此利用單一指標(biāo)很難反映植物抗寒性實(shí)質(zhì)，應(yīng)同時(shí)采用多種方法進(jìn)行相互驗(yàn)證才能得到比較準(zhǔn)確的結(jié)論［6］。

圖1 油棕葉片橫切面（100×）

圖2 油棕葉片中脈橫切面（100×）