韓向峰，李志芳，曹 琴，張海平，程小愛

（1.佛山市農業(yè)科學研究所，廣東 佛山 528145；2.山西農業(yè)大學園藝學院，山西 太谷 030800；3.定襄縣國有林場，山西 定襄 035400；4.太谷縣農業(yè)委員會，山西 太谷 030800）

鈣果，種名歐李（Cerasus humilisBunge），果實中含有豐富的維生素、礦物質、蛋白質和各種氨基酸，每100 g含鈣量達60 mg，被稱為天然的補鈣水果［1-6］。山西農業(yè)大學經(jīng)過近30年的研究，已選育出農大4號、農大5號等系列優(yōu)良品種，為鈣果的人工栽培提供了豐富的良種資源。采用組織培養(yǎng)可以迅速擴大良種苗木，由于鈣果樹體矮小、結果早，離體再生技術不僅可以繁育良種苗木，還可作為基因轉化、功能基因驗證提供一種適宜于果樹的模式植物，為果樹的品種改良提供有效的生物技術途徑。目前，關于鈣果誘導器官分化、再生的研究已有一些報道［3，5］，但在品種、外植體來源、輔助處理、煉苗移栽等方面還不夠完整。本研究從鈣果葉片誘導不定芽、芽的繼代增值、生根和馴化移栽成苗到最終建立完整的無性繁殖體系進行試驗，為完善鈣果植株再生體系研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2011年將山西農業(yè)大學園藝研究所溫室中的農大5號鈣果2年生苗及其組培實驗室中的組培繼代苗、壯苗引種到佛山市農科所的溫室和組培室。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的處理 從溫室中取2年生農大5號鈣果苗新梢頂端2～3片剛展開的嫩葉，放入燒杯。葉片經(jīng)75%酒精30 s和2%次氯酸鈉2 min消毒后，用無菌水再清洗3～4次，置于無菌濾紙吸干表面水分，葉片切去邊緣，并切去與滅菌劑接觸過的一段葉柄，接入培養(yǎng)基中。直接切取組培瓶中的繼代苗和壯苗中上部已展開的葉片用于試驗培養(yǎng)。

1.2.2 葉片誘導不定芽培養(yǎng)基的篩選 基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，日常光照時間為14 h/d，光照強度2 000 lx左右，培養(yǎng)溫度24（±2）℃。

（1）不同生長調節(jié)物的篩選。采用培養(yǎng)基 IAA（0、0.05、0.1 mg/L），NAA（0、0.05、0.1 mg/L），6-BA（0.8、1.0、1.2 mg/L）， 培養(yǎng)基〔MS、1/2MS（半）、1/2MS（全）〕4因素3水平正交試驗設計，共9個處理，每個處理接種5～6瓶，每瓶放3～4個葉片，兩次重復，其中1/2MS（半）指MS的大量元素用量減半；1/2MS（全）指MS的全部元素用量減半。將葉片滅菌后去其邊緣，在與葉片主脈垂直方向橫切兩刀，使其邊緣相連，內部均分為3部分后葉背向上放置于培養(yǎng)基上。觀察葉片的動態(tài)變化，調查發(fā)生愈傷組織和不定芽誘導的情況。

（2）AgNO3、照光、葉片放置方式、部位等因素篩選。以不定芽誘導率較高的8號和6號培養(yǎng)基為基礎，將葉片去頭去尾，再切掉邊緣，將葉片均勻切成葉尖、葉中和帶一點葉柄的葉基3部分。設置AgNO3（0、0.1、0.2 mg/L）、照光（全光照、暗培養(yǎng)、無光照）、放置方式（正放、反放、側放）、部位（葉基、葉中、葉尖）4因素3水平正交試驗，其中正放指葉背接觸培養(yǎng)基；反放為指葉面接觸培養(yǎng)基；側放指與主脈相平行的葉緣一邊垂直插入培養(yǎng)基中一半，共9個處理，每個處理兩個重復，每個重復6瓶，接種30 d后，觀察其誘導效果，計算誘導率。

芽誘導率（%）=再生出不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100

1.2.3 葉片誘導出不定芽的繼代培養(yǎng) 將葉片誘導出的不定芽先在MS+IAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基中壯苗后，再接種到MS+6-BA 0.05 mg/L+IAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基上循環(huán)壯苗，觀察其芽苗生長狀態(tài)。將經(jīng)過壯苗的莖段和莖尖轉接到MS+6-BA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上分化培養(yǎng)，兩次重復，每次重復接種30個高約1 cm的健壯繼代莖段，20 d后調查其總增殖數(shù)、增殖率、分化芽的健壯情況及其可利用程度。

1.2.4 葉片再生不定芽的生根培養(yǎng) 葉片再生不定芽在MS+6-BA 0.05 mg/L+IAA 0.05 mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)22 d后，選長勢健壯的莖段部分進行繼代培養(yǎng)，部分截取1.5 cm左右莖尖接種到生根培養(yǎng)基：1/2MS+IAA 1.2 mg/L，2次重復，每個重復接種5瓶，每18根一瓶，15 d后調查其生根率。

1.2.5 葉片再生植株的煉苗與移栽 （1）第一階段：光培煉苗、閉瓶煉苗和開瓶煉苗。組培苗在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)約15 d后，根系長到0.5～1.0 cm，將生根苗玻璃瓶移入室溫25～28℃、光照5 000～8 000 lx的溫室進行光培閉瓶煉苗。10 d后生根苗有新葉長出，葉片變大增厚，根系長到約3 cm，植株已復壯。此時將封口膜打開進行開瓶煉苗。將1 000倍的多菌靈液加入生根苗瓶內，殺菌液的高度約0.5 cm，在室溫25～28℃、光照5 000～8 000 lx條件下開瓶煉苗2～3 d。煉苗過程中，對煉苗溫室也要進行殺菌消毒。

（2）第二階段：基質煉苗。瓶內煉苗后，將生根苗輕輕從玻璃瓶取出，用1 000倍多菌靈液清洗消毒后移栽到消過毒的基質（深層土：泥炭：河沙：珍珠巖）中，澆透水，并扣小拱棚，上面加蓋遮陽網(wǎng)，約40 d后，幼苗基本由異養(yǎng)為主變成自養(yǎng)能適應溫室環(huán)境，完成馴化過程。

（3）第三階段：營養(yǎng)杯煉苗?；|煉苗后，苗長5～8 cm，當基部開始半木質化，根系變?yōu)楹稚?，有大量的毛細跟產(chǎn)生時，將幼苗移栽到營養(yǎng)杯中，澆透水，并扣小拱棚緩苗一周。之后去掉小拱棚，小苗開始快速生長。約30 d煉苗生長后，去掉營養(yǎng)杯，帶上土坨定植到大田中，進行正常的田間管理。最后調查煉苗移栽成活率。

試驗數(shù)據(jù)采用鄧肯方差分析進行處理。

2 結果與分析

2.1 葉片誘導不定芽的動態(tài)變化

鈣果葉片在接種3 d彎曲隆起開始啟動，葉柄部位開始逐漸膨大。培養(yǎng)10 d左右，葉柄傷口部位和主脈傷口部位產(chǎn)生少量愈傷，同時從葉柄的形成層處與產(chǎn)生愈傷的結合處出現(xiàn)綠色芽點，有的從膨大葉柄上分化出綠色芽點，有的從愈傷組織中分化出綠色芽點。3 d左右即可看到幼小的芽體長出，從小芽體周圍分化出簇狀幼芽，并不斷增多，一個誘導部位最多可以分化30多個芽體，但芽的質量有強弱之分。其次產(chǎn)生芽的部位為葉片中部主脈傷口處，且?guī)缀醵际菑娜~背上誘導出芽。誘導出芽的時間主要集中在接種后10～15 d，約有90%的不定芽都在此時間段內誘導出來，且多數(shù)不定芽較壯，但部分芽出現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象（圖1，封二）。此后仍有少量芽繼續(xù)從葉片邊緣或其他部位產(chǎn)生，但一般誘導出的不定芽較弱。

2.2 培養(yǎng)基和不同植物生長調節(jié)劑對葉片誘導芽再生的影響

2.2.1 溫室葉片誘導芽 從表1可以看出，8號處理的不定芽再生誘導率平均達41.05%，6號處理次之，平均誘導率為31.6%，其他處理均較差。由極差分析可知，培養(yǎng)基是影響不定芽誘導的主要因子。各因素的主次關系為培養(yǎng)基＞NAA＞6-BA＞IAA，最佳培養(yǎng)基及激素配比為1/2MS（全部元素減半）+IAA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.8 mg/L，即8號處理最佳。次之為1/2MS（大量元素減半）+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L（與6號處理中的6-BA稍有差異）。

通過上述分析，篩選出鈣果溫室葉片誘導不定芽的最佳培養(yǎng)基為1/2MS（全部元素用量減半），其次為1/2MS（大量元素用量減半），生長調節(jié)劑配比為IAA 0.1 mg/L、NAA 0.05 mg/L和6-BA 0.8 mg/L，其次為IAA 0.05 mg/L、NAA 0.1 mg/L和 6-BA 1.0 mg/L。

表1 培養(yǎng)基和植物生長調節(jié)劑對溫室葉片的芽誘導

2.2.2 組培繼代分化苗葉片誘導芽 從表2可以看出，9個處理組合的不定芽再生誘導中，6號處理最好、平均誘導率達44.38%，最高達68.75%。由極差比較可知，IAA的極差最大，是影響繼代分化苗葉片不定芽再生的主要因子。各因素的主次關系為：IAA＞培養(yǎng)基＞NAA＞6-BA，本試驗中最佳培養(yǎng)基及植物生長調節(jié)劑配比為：1/2MS（大量元素用量減半）+ IAA 0.05 mg/L+ NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.8 mg/L，即6號處理。

表2 培養(yǎng)基和植物生長調節(jié)劑組合對分化苗葉片的芽誘導

2.2.3 組培繼代壯苗葉片誘導芽 從表3可以看出，9個處理組合的不定芽再生誘導中，6號處理最好，平均芽誘導率為25.66%。由極差比較可知，NAA的極差最大，是影響繼代壯苗葉片不定芽再生的主要因子。各因素的主次關系為NAA＞IAA＞培養(yǎng)基＞6-BA，本試驗中最佳培養(yǎng)基及植物生長調節(jié)劑配比為：1/2 MS（大量元素減半）+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.8 mg/L，即6號處理。

可見，盡管葉片來源不同均可以誘導出不定芽。適合于溫室葉片誘導不定芽再生的最佳培養(yǎng)基為1/2MS（全部元素減半）+IAA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.8 mg/L，即8號處理。其最高誘導率為42.1%，影響此類葉片不定芽誘導因素的主次關系為培養(yǎng)基＞NAA＞6-BA＞IAA，各因素水平影響誘導效果的順序依次為NAA＞培養(yǎng)基＞6-BA＞IAA。適合組培繼代苗和壯苗葉片誘導不定芽再生的最佳培養(yǎng)基為1/2MS（大量元素減半）+IAA 0.05 mg/L+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.8 mg/L，即6號處理。不管分化苗還是壯苗，影響不定芽誘導的最主要因子均為生長素類，最次的因素為細胞分裂素6-BA。

表3 培養(yǎng)基和植物生長調節(jié)劑對壯苗葉片的芽誘導

2.3 AgNO3、光照、放置方式、部位等處理組合對誘導不定芽的影響

2.3.1 在6號培養(yǎng)基中對芽再生的影響 從表4可以看出，處理9的不定芽誘導率最好，即在培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L AgNO3、用帶一段葉柄的葉基部位、反放，無光條件下培養(yǎng)，平均誘導率達25%，其最高誘導率為35%；處理7次之，平均誘導率達20.0%；極差比較可知，AgNO3是影響6號培養(yǎng)基不定芽誘導率的主要因素。同時看出，影響因素的主次關系為：AgNO3＞放置方式或葉片部位＞光照?？梢?，處理組合為在全光照條件下，以帶葉柄的葉基部分為材料，AgNO30.2 mg/L，將葉片反放在6號培養(yǎng)基上最佳。

表4 6號培養(yǎng)基不同處理組合對芽再生的影響

2.3.2 在8號培養(yǎng)基中對芽再生的影響 從表5可以看出，處理9組合的不定芽誘導率表現(xiàn)最好，即在培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L AgNO3、采用無光、葉片反放、用帶一段葉柄的葉基部位處理的平均誘導率達22.5%，其最高誘導率為25%；極差比較可知，葉片部位的極差最大，是影響8號培養(yǎng)基不定芽誘導率的主要因素。影響因素的主次關系表現(xiàn)為：葉片部位＞放置方式＞AgNO3＞光照，最佳處理組合為：在暗培養(yǎng)條件下，以帶葉柄的葉基部分為材料，AgNO30.2 mg/L，葉片反放在8號培養(yǎng)基上，與9個處理組合在6號培養(yǎng)基上的最佳組合結果基本一致，但不同的是在8號培養(yǎng)基上的芽誘導率整體上沒有在6號培養(yǎng)基的高，可能是因為NAA對誘導芽的作用較IAA好。

表5 在8號培養(yǎng)基上不同處理組合對芽再生的影響

綜上可知，4個影響不定芽誘導率的因素中，葉片部位、葉片放置方式和AgNO3均影響不定芽再生，且處理水平也一致，均為帶葉柄葉基、葉片反放、AgNO3均為0.2 mg/L。而光照條件影響最小，各水平之間無顯著性差異。

2.4 葉片再生不定芽的繼代、生根培養(yǎng)與馴化培養(yǎng)

由試驗結果可知，農大5號不定芽在繼代培養(yǎng)中平均增殖率為2.97%，且芽苗多數(shù)都生長短粗、健壯，無玻璃苗產(chǎn)生；在生根培養(yǎng)中平均生根率為89.17%，最高生根率達到90%，生根條數(shù)均在2條以上，長勢良好（圖2，封二）。農大5號煉苗成活率高達到77.5%，可見鈣果組培苗的適應性非常強。

3 結論與討論

已有研究表明，硝酸銀可抑制乙烯的合成，促進愈傷組織再生芽的能力，可以增加外植體產(chǎn)生不定芽的數(shù)目及提高植株再生頻率［6-9］。本試驗結果表明，相對于其他試驗因素而言，硝酸銀對不定芽再生有較大影響，這與前人分析結果一致，但對于不定芽誘導率的整體提升表現(xiàn)效果不明顯。暗培養(yǎng)或弱光條件有利于誘導細胞分裂，可以提高葉片再生［5，10-11］。在葉片誘導愈傷組織的預實驗中，也發(fā)現(xiàn)葉片在弱光或光暗培養(yǎng)下誘導愈傷組織產(chǎn)生的時間較全光照提前3～5 d，且愈傷組織在相同時間段產(chǎn)生的量也較全光照條件下多，這與多數(shù)報道的結論一致。本試驗中用葉片直接誘導不定芽的試驗結果表明，光照條件對葉片再生試驗的影響都不顯著，且不定芽的再生也未見明顯提高。

本試驗結果表明，帶葉柄的葉基再生不定芽的能力最強，與師校欣等在櫻桃砧木離體培養(yǎng)中得出的結論［12-20］一致。關于葉片的放置方式，一般認為雙子葉植物葉背面有大量氣孔，葉背面與培養(yǎng)基接觸，有利于營養(yǎng)吸收，因此，采用葉背接觸培養(yǎng)基較多。在本試驗中，葉片正面接觸培養(yǎng)基明顯的較葉背面接觸培養(yǎng)基效果好。因此葉片的放置方式對誘導不定芽的影響，也可能因不同的樹種而有所差異。其他樹種（如蘋果、海棠、草莓、梨、黃楊等）上也有類似現(xiàn)象。

本試驗僅對MS培養(yǎng)基元素添加的量進行了研究，未涉及其他類型的培養(yǎng)基，其后可以繼續(xù)研究。就MS培養(yǎng)基來說，以全部元素或大量元素減半為好。就植物生長調節(jié)劑來看，生長素對芽的誘導要比細胞激動素更為重要，因此，對于鈣果芽誘導，細胞激動素的濃度應相對固定，應更多考慮調配生長素如NAA、IAA的濃度。

組培苗是在人工控制條件下生長，移出試管后即由異養(yǎng)轉為自養(yǎng)，環(huán)境條件的劇烈變化，影響著組培苗的成活率。組織培養(yǎng)苗能否大量應用于生產(chǎn)，特別是木本植物能否取得好的效益，取決于組培苗能否有高的成活率，對移栽的基質、溫度、濕度及光照等都要加以嚴格控制。

圖1 鈣果葉片直接誘導不定芽

圖2 鈣果葉片誘導不定芽的增殖（A）、生根（B）與煉苗（C）