馬 雪，孫淑文，李 楊，孫燕飛，雷勇輝

（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003，2.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

新疆地處我國西北邊疆（73～96°N、34～48°E），地理位置特殊，地質(zhì)地貌多樣，整體氣候干旱少雨，微生物資源特殊［1］。酵母菌在自然環(huán)境中分布較為廣泛，湖泊和海洋酵母菌也日益受到關(guān)注與研究［2］，西藏拉魯?shù)臐竦赝寥溃?］、云南程海湖泊［4］、釀造白酒的大曲［5］、南極德雷克海峽表層海水［6］中都有發(fā)現(xiàn)酵母菌分布。新疆獨特的氣候造成不同地區(qū)酵母菌的多樣性差異。研究發(fā)現(xiàn)，新疆釀酒酵母菌群結(jié)構(gòu)特征明顯受到多變的地域氣候、種植的葡萄品種等多重影響［7］。月季（Rosa chinensisJacq.）屬薔薇科，在我國已有悠久的栽培歷史［8］。月季花繁葉茂、香味濃郁，被譽(yù)為“花中皇后”［9］，其提取物或某些成分在抗氧化、抗衰老等方面具有較好的生物活性及藥理作用［10］。通過空氣傳播和（或）傳粉者的喙接觸花蜜及花冠［11］，一般每一花蜜樣品中平均含1～2種酵母菌［12］；在蜂的口器及消化道中分離出的花蜜微生物能加工多肽、多糖等［13］，可見研究花蜜微生物可以更好地了解植物-微生物-傳粉者間的作用關(guān)系［11］。目前對新疆花卉中酵母菌的研究報道較為罕見。因此本試驗利用26S rDNA高通量測序技術(shù)及可培養(yǎng)酵母菌的分離純化鑒定，對石河子月季花中酵母菌物種多樣性進(jìn)行全面研究，明確月季花上主要酵母種類及其門屬分布特點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2017年9月初到10月底在石河子公園采用五點取樣法采摘開花期月季若干，將花瓣樣品裝入滅菌信封，放入冰盒，帶回石河子大學(xué)實驗室，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

供試培養(yǎng)基YPD液體培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、YM培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)［14］制備，糖類發(fā)酵培養(yǎng)基、碳源同化基礎(chǔ)培養(yǎng)基、缺維生素培養(yǎng)基、尿素瓊脂參照文獻(xiàn)［15］制備。

試驗主要儀器與設(shè)備包括ZHWY-100B 搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）、HWS恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、Applied Biosystems ProFleX PCR System儀器（Life Technologies公司）、Eppendorf 5424R高速冷凍離心機(jī)、SW-CJ-1F 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 月季附生酵母菌群（可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)）的高通量測序分析 將月季花瓣與無菌水按1∶2比例置于錐形瓶中，3個重復(fù)，搖床24 h后將花瓣在無菌條件下過濾，濾液用0.45 μm的濾膜進(jìn)行抽濾，對抽濾后的濾膜提取DNA，送樣至上海派森諾生物科技有限公司，對樣品26S rDNA D1/D2區(qū)進(jìn)行高通量測序，測序引物為NL-1和NL-2，引物序列分別為5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和5′-CTTGTTCGCTATCGGTCTC-3′。利用Illumina(MiSeq)平臺，對獲得的序列進(jìn)行可操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）歸并劃分，每個OTU的代表序列用于分類地位鑒定，在屬水平對菌群進(jìn)行聚類分析，根據(jù)聚類結(jié)果分析月季中酵母菌群落豐富度的差異。

1.2.2 α多樣性分析 對新疆石河子地區(qū)月季高通量測序結(jié)果進(jìn)行α多樣性的相關(guān)分析，在97%分類水平上，采用QIIME（1.8.0版）軟件計算樣品的豐富度和多樣性指數(shù)。多樣性指數(shù)包括Chao1豐富度估計指數(shù)、ACE豐富度估計指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、Simpson 多樣性指數(shù)。

1.2.3 可培養(yǎng)酵母菌菌株分離與保藏 為較全面地獲得月季花上的附生酵母菌，采用稀釋涂布法和孢子彈射法進(jìn)行酵母菌的分離培養(yǎng)［14］，兩種方法分別做3個重復(fù)。

稀釋涂布法：按照1.2.1中相同的步驟，在無菌條件下將抽濾后的濾膜放入錐形瓶中，加入100 mL無菌水稀釋混勻，吸取100 μL涂布于PDA平板，28℃恒溫培養(yǎng)48～72 h后，挑選單個菌落并制作水浸裝片，在顯微鏡下初步觀察，將初步確認(rèn)為酵母菌的單菌落在PDA平板上進(jìn)行無菌操作，劃線純化2～3次，獲得純培養(yǎng)物。孢子彈射法：將月季花瓣貼于PDA固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿蓋內(nèi)，讓酵母菌的孢子彈射在培養(yǎng)基上生長，然后挑取單菌落按照相同的操作步驟進(jìn)行純培養(yǎng)。純化菌株采用PDA斜面和干粉冷凍保藏［16-17］。

1.2.4 可培養(yǎng)酵母菌生理生化檢測及系統(tǒng)發(fā)育分析 根據(jù)酵母菌分類學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)研究方法，對菌株進(jìn)行菌落形態(tài)、細(xì)胞顯微形態(tài)分析及生理生化鑒定［9,13］。將獲得的酵母細(xì)胞接種在5 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)過夜，離心收集細(xì)胞，用CTAB法提取DNA后進(jìn)行26S rDNA基因的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（25μL）：DNA 1 μL、Taq聚合酶（5 U/ L）1 μL 、10×TaqE buffer 2.5 μL、dd H2O 15 μL 、25 mmol/L MgCl21.5 μL、d NTP（2.5 mmol/L）2 μL。PCR反應(yīng)程序為95℃1 min；95℃10 s、60℃20 s、72℃ 40 s，35 個循環(huán)［16］。26S rDNA基因的擴(kuò)增引物為NL-1和 NL-4。NL-1引 物 序 列 同 1.2.1，NL-4為5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測后送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。采用DNAStar軟件對酵母菌的26S rDNA D1/D2序列進(jìn)行分析，登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列比對，下載相關(guān)序列，通過MEGA7.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，參照文獻(xiàn)［15］進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果與群落結(jié)構(gòu)組成分析

將月季花樣品中提取的DNA進(jìn)行MiSeq高通量測序并優(yōu)化后，共獲得41 337條高質(zhì)量且有效的序列，通過OTU聚類分析得到3 078個OTU，酵母菌群落進(jìn)一步優(yōu)化分類得到鑒定結(jié)果為3個門、10個綱、13個目、22個科、37個屬、90個種。

門水平上，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為優(yōu)勢門、占18.9%，子囊菌門（Ascomycota）占1.3%；屬水平上，OTU分類鑒定結(jié)果為37個酵母菌屬，為擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、南極假絲酵母屬（Pseudozyma）、紅酵母屬（Rhodotorula）、畢赤酵母屬（Pichia）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）、棒孢酵母屬（Clavispora）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、克氏擔(dān)孢酵母屬（Kurtzmanomyces）、絲孢酵母屬（Trichosporon）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、擬威克酵母屬(Wickerhamiella)、假絲酵母屬（Candida）、線黑粉菌屬（Filobasidium）、Cystof i lobasidium、Udeniomyces、Tremella、Papiliotrema、Kwoniella、Tetrapisispora、Prototheca、Holtermannia、Yamadazyma、Trimorphomyces、Curvibasidium、Itersonilia、Malassezia、Moniliella、Hyphopichia、Cyniclomyces、Komagataella、Geotrichum、Lachancea、Hanseniaspora、Bannoa、Mrakia，反映月季花中附生酵母菌群落多樣性豐富。

聚類分析結(jié)果顯示，在可鑒定的菌群中，屬水平上酵母菌群共占20.2%（圖1），優(yōu)勢酵母菌屬為線黑粉菌屬（Filobasidium）、占12.2%，其次為Udeniomyces、占3.3%，Cystof i lobasidium占1.6%，其他屬占0.1%～0.7%不等，表明月季附生酵母菌群落豐富度差異較大。

2.2 α多樣性分析

α多樣性分析常用的度量指數(shù)主要包括側(cè)重于體現(xiàn)群落豐富度的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)，以及兼顧群落均勻度的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，利用QIIME（1.8.0版）軟件計算結(jié)果為 Chao1指 數(shù) 623.00，ACE指 數(shù) 623.00， 表明OTU數(shù)目較多，月季花中微生物群落豐富度很大；Simpson指數(shù)0.94，Shannon指數(shù)5.68，Simpson指數(shù)與其他多樣性指數(shù)均呈負(fù)相關(guān)，Shannon指數(shù)呈正相關(guān)，說明月季花中微生物群落多樣性較高。

2.3 可培養(yǎng)酵母菌生理生化檢測及系統(tǒng)發(fā)育分析

圖1 屬水平上酵母菌群豐度值

表1 酵母菌形態(tài)學(xué)觀察及形態(tài)特征

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定（圖2，封二、表1），4個菌落形態(tài)都為圓形，Y1b-1顏色為奶白且雙端芽殖，其余3個菌落細(xì)胞都為單端芽殖，Y1b-2和Y1c-1顏色都為乳白，Y1c顏色為淡粉，從形態(tài)學(xué)鑒定可初步估計Y1b-2和Y1c-1為同一屬。對采用26S rDNA D1/D2區(qū)域測序，利用MAGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對所分離的4株酵母菌進(jìn)行系統(tǒng)分類鑒定，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果（圖3）顯示，4種菌株與各自的模式菌株聚在一枝，表明系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類結(jié)果與26S rDNA D1/D2區(qū)堿基序列的同源率鑒定結(jié)果（在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索BLAST后，4株酵母菌與最近緣種的模式菌株相似率都為99%）一致；且相同屬的菌株歸于同一分枝，具有較近的親緣關(guān)系，而不同屬則相距較遠(yuǎn)。結(jié)果顯示分離菌株屬于畢赤酵母屬（Pichia）、紅酵母屬（Rhodotorula）、隱球酵母屬（Cryptococcus）3個屬，優(yōu)勢酵母屬為隱球酵母屬（Cryptococcus）；結(jié)合生理生化實驗結(jié)果（表2、表3）分析，4個菌株的發(fā)酵糖類實驗、同化碳源實驗等生理生化實驗結(jié)果參照文獻(xiàn)［15］確定酵母菌種，Y1b-1為畢赤酵母屬（Pichia）季也蒙畢赤酵母（Meyerozymaguilliermondii）、Y1c為紅酵母屬（Rhodotorula）粘性紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、Y1b-2為隱球酵母屬（Cryptococcus）烏茲別克斯坦隱球酵母（Cryptococcusuzbekistanensis）、Y1c-1為隱球酵母屬（Cryptococcus）淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）。

圖2 酵母菌菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)

圖3 基于酵母26S rDNA D1/D2 區(qū)序列構(gòu)建的新疆石河子地區(qū)月季花酵母菌系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 酵母菌糖發(fā)酵鑒定及相關(guān)生理生化指標(biāo)鑒定結(jié)果

表3 酵母菌碳源同化實驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，新疆石河子月季花附生酵母菌群落結(jié)構(gòu)豐富，鑒定劃分為3個門、10個綱、13個目、22個科、37個屬、90個種；擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為優(yōu)勢門、占18.9%，線黑粉菌屬（Filobasidium）為優(yōu)勢屬、占12.2%；可培養(yǎng)的酵母菌鑒定為季也蒙畢赤酵母（Meyerozymaguilliermondii）、粘性紅酵母（Rhodotorulamucilaginosa）、烏茲別克斯坦隱球酵母（Cryptococcusuzbekistanensis）、淺白隱球酵母（Cryptococcusalbidus），屬于畢赤酵母屬（Pichia）、紅酵母屬（Rhodotorula）、隱球酵母屬(Cryptococcus) 3屬4種，優(yōu)勢酵母屬為隱球酵母屬(Cryptococcus)。通過新疆石河子月季花酵母多樣性的研究，探明了新疆月季花酵母菌種群的分布特征，為潛在的酵母菌資源利用提供數(shù)據(jù)，并為探索花蜜微生物與植物相互作用提供理論依據(jù)。

本研究利用26S rDNA D1/D2區(qū)域序列的高通量測序，分析新疆石河子地區(qū)月季花附生酵母菌，由于引物NL1和NL4是酵母菌測序的通用引物，但高通量測序時片段過大，故本研究采用引物NL1和NL2，OTU分類鑒定結(jié)果為屬水平上劃分到37個酵母菌屬，占比超過20%，基本能反映月季花中酵母菌群落結(jié)構(gòu)。此外還鑒定到其他微生物菌群，有枝孢屬（Cladosporium）、擬南芥屬（Arabidopsis）、小球腔菌屬（Leptosphaeria）等，因此本試驗所用的引物還有一些局限性，需要進(jìn)一步研究改進(jìn)。

可培養(yǎng)酵母菌僅分離鑒定獲得4株酵母菌株，與高通量測序結(jié)果相比，表現(xiàn)為菌株多樣性偏低。研究表明花蜜所含的抗菌化合物等［18］可能會限制花蜜中的微生物種類及其群落構(gòu)成［11］，對月季花冠也會帶來影響。而石河子地區(qū)的早晚溫差大，氣候相對干燥，對酵母菌的生長會有影響，已有研究證明酵母菌的發(fā)生率、密度及多樣性受地區(qū)因素極大［11］；另外，本試驗在培養(yǎng)分離酵母菌時用的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)環(huán)境等條件對于研究酵母菌的生長還存在局限，使可培養(yǎng)獲得的酵母菌株多樣性較少，對于本地區(qū)月季花上酵母菌的多樣性培養(yǎng)條件還有待進(jìn)一步改進(jìn)。

從高通量測序聚類結(jié)果來看，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為優(yōu)勢門占18.9%，子囊菌門（Ascomycota）占1.3%。子囊菌門的酵母菌通常易出現(xiàn)在蔗糖主導(dǎo)的花蜜中［19］，而低濃度的己糖主導(dǎo)花蜜則利于擔(dān)子菌門酵母菌在此種花蜜中的孕育［11］，這可能與月季花的花蜜濃度低有關(guān)，使得花冠的酵母菌也以擔(dān)子菌門為主，其中擔(dān)子菌門有9屬：隱球酵母屬（Cryptococcus）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）、線黑粉菌屬（Filobasidium）、Udeniomyces、Cystofilobasidium、Tremella、Papiliotrema、Kwoniella、Holtermannia；其余7屬為子囊菌門：假絲酵母屬（C a n d i d a）、畢赤酵母屬（Pichia）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyce）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、擬威克酵母屬（Wickerhamiella）、Tetrapisispora、Prototheca，可培養(yǎng)分離得到的酵母菌擔(dān)子菌門有2屬，為紅酵母屬（Rhodotorula）、隱球酵母屬(Cryptococcus)，子囊菌門僅1屬，即畢赤酵母屬（Pichia），這與Pozo等［20］的研究結(jié)果一致，表明子囊菌門的假絲酵母屬（Candida）與擔(dān)子菌門的紅酵母屬（Rhodotorula）、隱球酵母屬(Cryptococcus)及擲孢酵母屬（Sporobolomyces）酵母菌在植物花蜜中常常出現(xiàn)，但發(fā)生率相對較低［11］。本研究結(jié)果顯示，石河子月季中，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）的酵母菌物種多樣性更為豐富，這可能與擔(dān)子菌門對環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng)有關(guān)。由于新疆地理環(huán)境特殊，嚴(yán)酷的生境及晝夜溫差利于糖分積累的條件可能有利于擔(dān)子菌門酵母在月季花上的進(jìn)化及生長。