葉振策，李 淵，韓艷君，周 玥，丁繼超

（大理大學基礎醫(yī)學院，云南大理 671000）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種造血系統(tǒng)惡性腫瘤性疾病。目前臨床多采用藥物化療等方法對其進行治療，已取得較好的效果，但難治和復發(fā)的情況仍未改善〔1-2〕，探究白血病藥物靶向治療的有效方法是白血病研究的關鍵點。本研究將CD34+CD38-LSCs移植入非肥胖型糖尿病∕重癥聯合免疫缺陷小鼠（NOD∕SCID小鼠）建立AML模型，旨在為治療白血病提供新的思路和方法。

1 材料

1.1 動物雄性NOD∕SCID小鼠12只，6～8周齡，體質量25～30 g。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2010-0012。在符合SPF標準的層流室中飼養(yǎng)。

1.2 細胞株K562細胞株為云南省細胞生物學重點實驗室饋贈。

1.3 藥品與試劑環(huán)磷酰胺水合物試劑（Sigma公司）；瑞氏染液試劑、臺盼籃染色試劑（南京建成生物科技公司）；Anti-CD34抗體、Anti-Alexa Fluor 647抗體（abcam公司）；免疫熒光一、二抗稀釋液（碧云天公司）；山羊血清（上海生工公司）；DAPI染色液、抗熒光淬滅劑（碧云天公司）；PBS（杭州四季青公司）；二甲苯、多聚甲醛、乙醇、Triton x-100（昆明科儀化玻有限公司）。

1.4 儀器超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；MC-6500血常規(guī)儀（庫貝爾生物科技有限公司）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；激光共聚焦熒光顯微鏡（德國Leica公司）；移液器（德國Eppendorf公司）；細胞計數板（上海涸宇機電科技有限公司）；細胞培養(yǎng)瓶及細胞培養(yǎng)板（美國Costar公司）；臺式離心機（中國湘儀公司）。

2 方法

2.1 CD34＋CD38－LSCs的分離純化及鑒定

2.1.1 CD34＋CD38－LSCs的分離純化 運用免疫磁珠分選法（MACS）分選CD34+CD38-LSCs細胞，將K562細胞懸液與抗體為human anti-CD38-APC的免疫磁珠充分混勻，LD分選柱放置于磁場分離器中，將混合液滴加入分選柱中，流出的為CD38-細胞群，吸附于柱上的即為CD34＋細胞群；按100 μL FcR blocking reagent：1×108個 CD38-細胞：100 μL CD34 microbeads：300 μL Buffer的比例充分混合均勻，迅速用活塞從分選柱中清洗出磁性標記細胞，洗下的細胞即為CD34＋CD38-細胞群。

2.1.2 臺盼藍染色檢測CD34+CD38-LSCs的活性取適量分選后的細胞懸液，滴加適量臺盼藍溶液，充分混勻后滴加至載玻片上，倒置顯微鏡選取多個視野進行觀察和計數。

2.1.3 流式細胞術檢測CD34＋CD38-LSCs的純度各取免疫磁珠分選前和分選后的細胞群1×106個，加入單克隆抗體human anti-CD34-FITC和human anti-CD38-APC，采用流式細胞術檢測APC和FITC的熒光信號。細胞純度（%）=（CD34+CD38-細胞數∕細胞總數）×100%。

2.2 實驗分組將NOD∕SCID小鼠隨機分為對照組、模型組，每組6只。細胞移植前2 d給予NOD∕SCID小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺2 mg∕（只·d），連續(xù)2 d；模型組：移植當天，在無菌條件下通過尾靜脈移植CD34＋CD38-LSCs，細胞量為2×107個∕只；對照組：移植當天，相同條件下尾靜脈注入等量等時的無菌PBS。

2.3 小鼠的一般情況實驗期間按照3次∕周的頻率觀察小鼠精神、食欲、活動能力、毛發(fā)狀況、腹部腫塊、體質量等情況，并做好記錄。

2.4 外周血血常規(guī)檢測第25天小鼠處死前，摘眼球取血，采血量1 mL∕只，EDTA-K2抗凝，全自動血常規(guī)檢測儀檢測外周血常規(guī)。

2.5 血涂片分析制備血涂片，瑞氏-吉姆薩染色，待干后即可鏡檢，中性樹膠封固。

2.6 小鼠骨髓象分析無菌分離的小鼠雙側股骨和脛骨，用PBS沖洗骨髓腔至顏色發(fā)白。吹打至細胞懸液，離心機離心細胞懸液，PBS洗滌1次，制備細胞爬片。瑞氏-吉姆薩染色，待干后即可鏡檢，中性樹膠封固。

2.7 肝臟病理學檢測第25天處死小鼠后取新鮮肝臟，在多聚甲醛中固定，在按照設置好的乙醇濃度梯度中依次進行脫水，在二甲苯中進行透明，石蠟包埋組織塊，冷凍切片后HE染色，乙醇脫水后二甲苯透明，晾干后即可鏡檢和封片。

2.8 免疫熒光染色鑒定腫瘤細胞來源在培養(yǎng)板中將已制備完成的細胞爬片用PBS浸洗3次，4%的多聚甲醛常溫固定15 min，PBS浸洗后用0.5%的Triton x-100通透細胞15 min，滴加6%正常山羊血清室溫封閉30 min，滴加熒光一抗Anti-CD34（稀釋比例為1：500）濕盒中4℃孵育過夜，復溫后滴加熒光二抗Anti-Alexa Fluor 647（稀釋比例為1：800）濕盒中37℃孵育30 min；PBS浸洗后滴加DAPI避光孵育5 min對標本進行染核，PBS浸洗后用含抗熒光淬滅劑封片，激光掃描聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

2.9 統(tǒng)計學處理運用SPSS 17.0軟件對數據進行統(tǒng)計學分析，采用析因設計、單因素方差分析方法，數據均以（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 CD34+CD38-LSCs的純度與活性流式細胞術測定結果顯示，分選前細胞中CD34＋CD38－LSCs細胞群百分比為（9.50±1.25）%，分離純化后CD34＋CD38-LSCs細胞群純度可達（95.86±1.75）%。臺盼藍染色測定結果顯示，分選后細胞活性為（94.35±2.25）%。提示通過MACS法分選得到的CD34＋CD38－LSCs有較高的純度和活性。見圖1。

圖1 分選前后CD34＋CD38－LSCs細胞純度

3.2 NOD∕SCID小鼠一般情況與對照組小鼠比較，模型組小鼠精神萎靡、步態(tài)不穩(wěn)、皮毛粗糙雜亂，小鼠腹部腫塊明顯大于對照組，第25天的模型組小鼠平均體質量明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組小鼠表現正常。見表1。

3.3 小鼠外周血常規(guī)檢測與對照組小鼠比較，模型組小鼠的外周血中白細胞數明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），紅細胞數、血紅蛋白數、血小板數明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組小鼠的白細胞數、紅細胞數、血紅蛋白數、血小板數都處于正常范圍之內。見表2。

表1 第25天小鼠平均體質量（±s，n=6）

表1 第25天小鼠平均體質量（±s，n=6）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別對照組模型組平均體質量∕g 28.49±0.73 23.29±2.63*

表2 各組小鼠外周血中白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板計數（±s，n=6）

表2 各組小鼠外周血中白細胞、紅細胞、血紅蛋白、血小板計數（±s，n=6）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別對照組模型組白細胞數量∕(1×109個∕L)3.83±0.81 9.87±0.45*紅細胞數量∕(1×1012個∕L)9.23±0.19 4.41±0.61*血紅蛋白數量∕(g∕L)133.00±7.00 88.67±3.51*血小板數量∕(1×109個∕L)712.67±228.30 280.67±55.81*

3.4 小鼠血涂片分析瑞氏-吉姆薩血涂片結果顯示，與對照組相比較，模型組小鼠血中白細胞比例明顯增加。見圖2。

圖2 小鼠血涂片染色（瑞氏-吉姆薩染色，400×）

3.5 小鼠骨髓象分析結果瑞氏-吉姆薩染色骨髓涂片結果顯示，與對照組相比較，模型組小鼠骨髓增生活躍，可見大量白細胞浸潤。見圖3。

圖3 小鼠骨髓涂片染色（瑞氏-吉姆薩染色，400×）

3.6 肝臟病理學檢測與對照組相比，模型組小鼠的肝小葉完整結構被毀壞，肝臟組織中大量白細胞浸潤，肝細胞出現水樣變性（圖4B中箭頭指示）。見圖4。

圖4 肝臟病理學檢測（HE染色，400×）

3.7 免疫熒光染色鑒定腫瘤細胞來源免疫熒光細胞化學檢測結果顯示，模型組骨髓細胞熒光明亮且清晰，出現明顯陽性表達，提示模型組小鼠骨髓細胞中有大量人源白血病細胞。見圖5。

圖5 各組免疫熒光鑒定骨髓中白血病細胞（1600×）

4 討論

白血病作為血液系統(tǒng)的惡性腫瘤，嚴重威脅著患者的健康。治療白血病的方法主要有化學藥物治療、放射治療、骨髓移植等。目前，化療仍是白血病治療的主要手段，隨著靶向藥物的不斷開發(fā)，化療治療白血病雖然已經取得了巨大進展，但長期使用化療藥物會產生耐藥性，此為白血病難治及復發(fā)的重要原因之一〔3〕。白血病的發(fā)病機制研究是白血病治療研究的關鍵，白血病動物模型構建是白血病機制研究及治療研究的前提基礎，本實驗通過尾靜脈移植CD34+CD38-LSCs構建急性髓系白血病小鼠模型，為白血病靶向治療藥物的研究提供實驗基礎。

白血病在人體內的機制十分復雜，建立高效的白血病動物模型，不僅能夠迅速地研究疾病的發(fā)生機制，同時可為相關疾病藥物的開發(fā)提供理論和實驗基礎。有研究表明，將白血病細胞直接移植入小鼠體內可成功構建白血病小鼠模型。接種過HL-60細胞的NOD∕SCID小鼠在第5周后會出現全身白血病表現〔4-5〕；也有研究表明，從白血病患者的骨髓中分離純化得到的CD34＋CD38－LSCs，移植入小鼠體內可成功構建白血病模型〔6-8〕。相比而言，白血病干細胞因其不僅能夠增殖分化，而且具有干細胞無限增殖的特點，移植入小鼠體內效果更好，更容易形成白血病。目前白血病研究應用的免疫缺陷小鼠主要有NOD∕SCID小鼠和重癥聯合免疫缺陷小鼠（SCID小鼠），其中NOD∕SCID小鼠相比SCID小鼠具有更高的移植效率，而且缺失T、B兩種淋巴細胞，多種腫瘤細胞都可以植入，發(fā)生排斥反應的幾率比較小，被廣泛應用于人類白血病模型建立以及白血病靶向治療藥物研究中〔9〕。

本研究通過尾靜脈移植CD34＋CD38－LSCs來構建NOD∕SCID小鼠急性髓系白血病模型，細胞免疫熒光檢測提示模型組小鼠的骨髓細胞中有大量人源白血病細胞。與對照組相比，模型組小鼠的一般情況發(fā)生變化：腹部腫塊明顯大于對照組，體質量明顯低于對照組；血液系統(tǒng)發(fā)生變化：模型組小鼠的外周血中白細胞總數明顯高于對照組；肝臟發(fā)生變化：模型組小鼠的肝小葉結構被破壞，肝細胞出現水樣變性，肝臟組織中大量白細胞浸潤。這些結果證明通過尾靜脈移植CD34＋CD38-LSCs可以成功復制急性髓系白血病小鼠模型，該模型的復制為白血病藥物的開發(fā)提供了實驗基礎〔10-11〕。