周飛飛，譚季春 ，徐小延，孔 琳，梁曉茵，董 萌，李萍萍

胚胎植入前遺傳學(xué)檢查(PGT)是通過對(duì)配子或胚胎的遺傳分析，選擇未見異常的胚胎植入子宮，包括胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（PGD）和胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)。PGD主要適用于染色體遺傳病篩查，在阻斷致病基因縱向傳遞的基礎(chǔ)上，避免遺傳病胎兒的出生[1]；PGS主要適用于染色體非整倍體的篩查，以提高著床率和活產(chǎn)率[2]。

高通量測(cè)序又名下一代測(cè)序和深度測(cè)序，以能一次對(duì)成千上萬的DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定為標(biāo)志，具有速度快、通量大、結(jié)果一致性好、簡(jiǎn)便高效等特點(diǎn)[3]?？蓪?duì)胚胎全基因組進(jìn)行檢測(cè)，僅需低深度、高通量測(cè)序，就能完成突變位點(diǎn)和胚胎染色體的檢查，并能發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)，保證低成本、快速完成胚胎的遺傳診斷，從而挑選無異常的胚胎植入子宮。筆者主要介紹開展高通量測(cè)序技術(shù)在胚胎植入前遺傳學(xué)檢查中的應(yīng)用情況。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年1月～2017年9月來醫(yī)院輔助生殖中心就診的患者，在自愿的原則下，納入符合PGS/PGD適應(yīng)證的夫婦，均簽署知情同意書，并通過醫(yī)院倫理委員會(huì)的認(rèn)可。PGS指征：自然流產(chǎn)≥3次或2次自然流產(chǎn)且至少其中一次流產(chǎn)組織基因檢測(cè)異常、反復(fù)種植失?。ㄒ浦矁?yōu)質(zhì)胚胎次數(shù)≥3，或移植≥10個(gè)可移植胚胎）、高齡（＞38歲）等；PGD指征：?jiǎn)位虿?、染色體病、HLA配型、線粒體病等。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)促排卵 篩選符合PGD/PGS適應(yīng)證的夫婦進(jìn)行試管嬰兒術(shù)前相關(guān)檢查，相關(guān)化驗(yàn)檢查合格后，進(jìn)行試管嬰兒促排流程，促排方案包括：長(zhǎng)方案、短方案、拮抗劑方案等，由臨床醫(yī)生根據(jù)患者自身情況選擇適合患者本人的方案。促排過程中，通過超聲及激素水平檢查評(píng)估卵泡發(fā)育情況，根據(jù)卵泡數(shù)量、大小和激素水平?jīng)Q定扳機(jī)日及用藥和藥量，并于扳機(jī)藥物注射36～38 h后取卵。

1.2.2 胚胎檢查 為了避免胚胎活檢取材時(shí)透明帶上多精子因素的干擾，在受精方式上采用卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)。卵裂期胚胎評(píng)分以Istanbul共識(shí)為標(biāo)準(zhǔn)[4]，囊胚期胚胎評(píng)分按照Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]。受精后的胚胎培養(yǎng)到第5～6 d時(shí)，選擇發(fā)育3期以上的囊胚進(jìn)行活檢；對(duì)4期的胚胎需對(duì)遠(yuǎn)離滋養(yǎng)層一側(cè)的透明帶進(jìn)行激光打孔，待滋養(yǎng)層細(xì)胞孵出，用活檢針取3～5個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行囊胚活檢?；顧z細(xì)胞在無鈣的磷酸鹽緩沖液吹吸后，裝入0.2 ml的無菌eppendorf管中，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因篩查（測(cè)序儀：IonProton，DA8600），挑選生物信息分析無異常的胚胎行解凍移植。對(duì)于成功妊娠者，須在孕16～20 w時(shí)行羊水穿刺檢查，確保100%隨訪。

1.3 隨訪 生殖中心專職人員通過電話方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，包括妊娠結(jié)果、羊水穿刺結(jié)果及整個(gè)孕期是否順利和胎兒出生情況等。

2 結(jié)果

共對(duì)251例的囊胚進(jìn)行了全基因組檢測(cè)，有155例可行胚胎移植。目前已有119例行解凍移植，妊娠率 71.4%（85/119），分娩率 35.3%（30/85），流產(chǎn)率 3.5%（3/85），引產(chǎn)率 1.2%（1/85），其余繼續(xù)妊娠中。見表1。

活檢胚胎1000例，胚胎檢出率92.5%，染色體平衡易位者122例；染色體羅伯遜易位者43例，染色體倒位者11例，單基因病者12例；Y染色體微缺失7例以及反復(fù)流產(chǎn)等共計(jì)251例，其中染色體異常占較大比例。見表2。

表1 行高通量測(cè)序的PGD/PGS患者的基本信息

3 討論

雖然本研究樣本量有限，但仍可以從表1、2中了解到，在PGS/PGD中應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)可降低流產(chǎn)率，提高妊娠率，也有效避免了基因病患者致病基因的縱向傳遞。共活檢了1000個(gè)胚胎，有檢測(cè)結(jié)果的胚胎數(shù)為925，檢出率為92.5%。未檢出的胚胎可能是由于活檢胚胎質(zhì)量差，或是樣本轉(zhuǎn)移異常，或是受當(dāng)前檢測(cè)技術(shù)水平影響等。共有119例行解凍移植，妊娠數(shù)85，妊娠率為71.4%，流產(chǎn)率為3.5%，大大增加了患者的妊娠率，降低了流產(chǎn)率。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)越來越成熟，憑借其速度快、準(zhǔn)確率高、通量高等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)滲透到生命科學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域[6]，如在病原微生物鑒定、腫瘤基因組序列測(cè)定以及臨床遺傳疾病的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷和篩查等方面。但由于其測(cè)序成本較高，還不能常規(guī)應(yīng)用到臨床中，而且由于其測(cè)序通量大，對(duì)于后期測(cè)序數(shù)據(jù)，較難分析。

表2 PGD/PGS患者遺傳學(xué)檢查基本信息及高通量測(cè)序結(jié)果

在對(duì)患者進(jìn)行隨訪時(shí)，有1例因男方羅氏易位來醫(yī)院就診要求行PGD助孕的患者，在妊娠13 w時(shí)行頸后透明帶掃描（NT）發(fā)現(xiàn)異常，引產(chǎn)后行組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胎兒患有Turner綜合征。PGS/PGD的取材經(jīng)歷了從卵母細(xì)胞極體到卵裂球到囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的發(fā)展過程，通過極體活檢僅能提供母源的遺傳信息，有其局限性；卵裂球活檢僅能提供1～2個(gè)卵裂球，且嵌合概率大，影響對(duì)胚胎的真實(shí)判斷。因此，現(xiàn)在幾乎均為囊胚滋養(yǎng)層活檢。在胚胎發(fā)育過程中，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育為胎兒，滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育為胎盤部分，活檢不影響胎兒發(fā)育，所以此取材部位越來越受推崇。但畢竟胎盤部位的基因結(jié)果并不能完全代表胎兒整體，且由以上可知測(cè)序技術(shù)本身有其局限性。同時(shí)也應(yīng)該充分認(rèn)識(shí)到，PGD/PGS還不是一種很完善的遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)，其安全性問題有待進(jìn)一步研究。此外，對(duì)于行PGS/PGD技術(shù)的子代安全性問題，還需要大樣本的追蹤隨訪。

綜上所述，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢查，可降低反復(fù)流產(chǎn)率及患病胎兒的出生率，提高臨床妊娠率。