李美芳，劉 敏，李玉蘭，李筱玲，王鐵杰

(深圳市藥品檢驗研究院,深圳藥品質(zhì)量標準研究重點實驗室，深圳 518057)

鹽酸伊托必利為第四代胃動力藥[1]，國內(nèi)制劑分別有片劑、膠囊劑和分散片劑。該品種為本院承擔(dān)的國家藥典委員會2010—2011年標準提高行動計劃研究課題和2012年國家藥品評價性抽驗品種。其制劑質(zhì)量標準共9個，均為注冊標準或新藥轉(zhuǎn)正標準，其中8個標準、3種劑型的含量測定方法均采用紫外分光光度法(UV法)。通過實驗研究，發(fā)現(xiàn)UV法使用的定性濾紙對含量測定結(jié)果影響很大，在溶液稀釋過程中溶液在移液管中特別容易掛壁，故建立測定鹽酸伊托必利片、分散片和膠囊的含量測定HPLC法，采用一步稀釋、0.45 μm濾膜濾過后直接進樣，省卻了稀釋步驟，既提高工作效率又避免誤差的產(chǎn)生。本文建立的含量測定方法收載于《中國藥典》2015年版二部[2]。BP(2018)、EP(9.2)、USP(40)、JP(XVII)均未收載該品種。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Alliance 2695-996液相色譜儀(美國沃特世公司)，UltiMate 3000液相色譜儀(德國戴安公司)，Alltima C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，Kromasil 100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，XS205DU十萬分之一型電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試藥 國內(nèi)3種劑型、9家生產(chǎn)企業(yè)(分別依次為A～I)共27批次樣品；鹽酸伊托必利對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100939-200701，含量：99.9%)；鹽酸伊托必利原料(生產(chǎn)企業(yè)E，批號100801，含量為100.1%)；乙腈為色譜純，Merk公司產(chǎn)品；磷酸二氫鉀為分析純；水為millipore超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Alltima C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相為0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 4.0)-乙腈(80∶20)，流速：1 ml/min，檢測波長：258 nm，柱溫：30 ℃，進樣量： 20 μl。理論板數(shù)按伊托必利峰計算不低于5 000，伊托必利峰與其他相鄰雜質(zhì)峰的分離度符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取鹽酸伊托必利對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含0.1 mg的溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品20片(粒)，精密稱定，研細或取內(nèi)容物混勻，精密稱取適量(約相當于鹽酸伊托必利50 mg)，置500 ml量瓶中，加水適量，超聲使鹽酸伊托必利溶解，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 專屬性試驗 按相應(yīng)處方分別配制9家生產(chǎn)企業(yè)的空白混合輔料溶液。分別精密量取對照品溶液、供試品溶液、空白輔料溶液和空白溶劑，按“2.1”項下色譜條件測定，空白輔料、空白溶劑對主峰均無干擾。見圖1。

2.4 線性范圍 精密稱取對照品約50 mg，置50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻(1 mg/ml)，分別精密量取適量，稀釋制成鹽酸伊托必利的濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/ml的溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以濃度C(mg/ml)對峰面積A進行線性回歸，得線性方程A=3.907×107C-9.90×104(r=0.999 9，n=6)。結(jié)果表明，鹽酸伊托必利的濃度在0.01～1 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗 選取樣品(批號為E10)進行考查。結(jié)果顯示，供試品溶液在常溫下放置1、2、4、6、10和16 h后分別進樣，供試品主峰面積無變化(RSD為0.06%)，說明溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗 分別取片劑(批號為C10)、分散片劑(批號為I14)、膠囊劑(批號為G4)各1批，配成3個濃度水平(相當于標示含量的80%、100%和120%)，每個濃度3份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，片劑平均含量為100.3%，RSD為0.4%；分散片劑平均含量為101.1%，RSD為0.6%；膠囊劑平均含量為109.6%，RSD為0.5%。

1.鹽酸伊托必利

2.7 加樣回收率試驗 取鹽酸伊托必利對照品約10 mg，精密稱定，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液；另取鹽酸伊托必利原料(含量為100.1%)約1.25 g，精密稱定，置500 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液；取供試品(片劑，批號為D21，含量105.8%；膠囊劑，批號G4，含量109.4%；分散片，批號I14，含量101.2%)細粉適量(約相當于鹽酸伊托必利25 mg)，精密稱定，每種制劑取9份(共27份)，分別置500 ml量瓶中，分別精密量取對照品儲備溶液6、10和15 ml各3份于上述量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為回收率測定供試品溶液；取上述溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，測得片劑平均回收率為101.8%，RSD為0.93%(n=9)；膠囊劑平均回收率為101.1%，RSD為0.68%(n=9)；分散片劑平均回收率為101.6%，RSD為0.85%(n=9)。見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

2.8 日間精密度 取片劑(批號C10)的供試品，在不同日分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，兩次的含量測定結(jié)果分別為100.7%和100.3%，表明日間精密度良好。 取分散片(批號I14)的供試品，在不同日分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，兩次的含量測定結(jié)果分別為99.6%和101.2%，表明日間精密度良好。 取膠囊(批號G4)的供試品，在不同日分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，兩次的含量測定結(jié)果分別為108.5%和109.4%，表明日間精密度良好。

2.9 耐用性試驗 選用2根不同品牌和規(guī)格的C18柱測定每個廠家1批樣品，共5批片劑、1批分散片、3批膠囊的含量。結(jié)果顯示，2根色譜柱測定結(jié)果基本一致，說明方法耐用性良好。

2.10 檢出限和定量限 以信噪比為3∶1，測得系統(tǒng)的最低檢測濃度為0.3 μg/ml，即最低檢測限為6 ng。以信噪比為10∶1，測得最低定量濃度為1.0 μg/ml，即最低定量限為20 ng。

2.11 樣品含量測定 取鹽酸依托必利制劑共27批，分別按 “2.2.1”和“2.2.2”項下制備對照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，按外標法計算鹽酸伊托必利的含量，結(jié)果見表2。

表2 含量測定結(jié)果(n=2)

3 討論

國內(nèi)9家生產(chǎn)企業(yè)，其中生產(chǎn)企業(yè)A采用二步稀釋，定性濾紙濾過后再用濾膜濾過，HPLC法測定；其余8家生產(chǎn)企業(yè)采用二步稀釋，定性濾紙濾過，UV法測定鹽酸伊托必利的含量。UV法采用的檢測濃度為10 μg/ml，新建的HPLC法采用的檢測濃度為0.1 mg/ml，因此在這9家生產(chǎn)企業(yè)各選取1批樣品，使用HPLC法的供試品溶液濾紙濾過后稀釋10倍作為UV法的供試品溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用濾紙過濾之后的含量測定結(jié)果低于不用定性濾紙過濾的含量測定結(jié)果，部分企業(yè)產(chǎn)品結(jié)果差值較大。見表3。

表3 不同方法的含量測定結(jié)果(n=2)

備注： *- HPLC： 50 mg→50 ml，濾紙過濾，取續(xù)濾液5 ml→50 ml，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液； *- UV ： 50 mg→50ml，濾紙過濾，取續(xù)濾液5 ml→50 ml，再取5 ml→50 ml； △ HPLC： 50 mg→500 ml，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液

與結(jié)果差距最大的生產(chǎn)企業(yè)D聯(lián)系，確認未用濾紙過濾的HPLC含量測定結(jié)果是否符合實際生產(chǎn)的投料量。經(jīng)企業(yè)反饋，確實存在根據(jù)中間體的含量測定結(jié)果而調(diào)整片重的情況，根據(jù)所詢問批次的片重記錄和理論片重的比較，認為未用濾紙過濾的HPLC含量測定結(jié)果是符合生產(chǎn)實際的。

另外在試驗過程中發(fā)現(xiàn)鹽酸伊托必利水溶劑的對照品溶液和供試品溶液在移液管中特別容易掛壁，如果有稀釋步驟，移液過程必須控制放液速度非常緩慢，否則影響試驗精度與準確度。

本文采用樣品直接稀釋到500 ml，0.45 μm濾膜濾過，HPLC法測定，省卻了稀釋步驟，既提高工作效率又避免誤差的產(chǎn)生，使測定結(jié)果能反映產(chǎn)品的真實含量，優(yōu)于多步稀釋的UV法，并能同時測定鹽酸伊托必利三種制劑的含量，操作簡便快捷，可用于鹽酸伊托必利的質(zhì)量控制。