王 沖，覃婷婷，徐 琳，韓 晶，芮 菁

(天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070)

牛磺酸化學(xué)名稱為2-氨基乙磺酸(NH2-CH2-CH2-SO3H)，又稱牛膽酸、牛黃素，生物學(xué)效應(yīng)廣泛，對于改善記憶能力、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)、降低血糖、抗腫瘤等方面均有積極作用[1-5]。?；撬岬慕Y(jié)構(gòu)相對簡單，產(chǎn)品由化學(xué)合成而來，合成過程中若產(chǎn)生具有較強(qiáng)生物活性的雜質(zhì)，不僅會降低藥物效用，甚至可能產(chǎn)生臨床應(yīng)用的安全性問題。雜質(zhì)A為?；撬嶂须s質(zhì)，經(jīng)本單位抽驗(yàn)檢測，不同廠家的產(chǎn)品中均有檢出，但其是否具有生物活性尚不明確。本研究采用L929細(xì)胞株對雜質(zhì)A進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評價，為制定雜質(zhì)限度，保障藥品質(zhì)量和安全提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 XS205DU型電子天平(梅特勒公司)；ECLIPSE TS100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；HERAcell○R240i型二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Fisher SCIENTIFIC)；Innova 40型恒溫?fù)u床(New Brunswick Scientific公司)；VELOCITY 18R離心機(jī)(離心半徑12 cm，Dynamica公司)；SpectiaMax M2型酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)；Attune NxT型流式細(xì)胞儀(Life Technologies公司)。

1.2 試藥 RPMI Medium 1640培養(yǎng)基(Solarbio公司，批號20170628)；胎牛血清(FBS,杭州四季青生物工程材料有限公司，批號20161225)；0.25% Trypsin-EDTA(Solarbio公司，批號20170316)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,Coty BioTech○R分裝，批號M0793)；二甲基亞砜(DMSO,天津市康科德科技有限公司，批號060515)；FITC AnnexinV/Dead Cell 凋亡試劑盒(Invitrogen公司，批號1809491)；FxCycleTM PI/RNAse Staining Solution 細(xì)胞周期試劑盒(Invitrogen公司，批號1825102)。

1.3 細(xì)胞株 小鼠成纖維細(xì)胞(L-929)，購自中科院上海細(xì)胞庫，以含10 %胎牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，定期傳代。

1.4 受試樣品 2,2’-亞氨基二(乙烷磺酸)二鈉(雜質(zhì)A)，白色粉末，易溶于水，天津藥物研究院合成，純度為99%以上，制備方法見圖1。試驗(yàn)時，用含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基將雜質(zhì)A配制成2.5、5及10 mg/ml 3個不同濃度的溶液使用。

圖1 雜質(zhì)A的制備方法

1.5 方法

1.5.1 對L929細(xì)胞的毒性作用 將處于對數(shù)生長期的L929細(xì)胞消化調(diào)整為濃度為1.5×104個/ml的細(xì)胞懸液，每孔0.1 ml接種于96孔板，37 ℃、5%(V/V)CO2條件下培養(yǎng)24 h。設(shè)置陰性對照組及雜質(zhì)A低、中、高濃度組，每組8個復(fù)孔。棄去原培養(yǎng)液，陰性對照組加入10% FBS-RPMI 1640,雜質(zhì)A低、中、高濃度組分別加入2.5、5和10 mg/ml的雜質(zhì)A溶液，每孔0.1 ml，于37 ℃、5%(V/V)CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24及48 h。終止培養(yǎng)前4 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并按表1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級。每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，每孔加入150 μl DMSO，放置約10 min后，振蕩使孔內(nèi)溶液顏色均勻，在酶標(biāo)儀570和630 nm波長下測定吸光度。以各組8個平行孔的平均吸光度值計(jì)算相對增殖率(RGR%)[6]。RGR%=雜質(zhì)A組平均吸光度值/陰性對照組平均吸光度值×100%。

1.5.2 對L929細(xì)胞凋亡的影響 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。取處于對數(shù)生長期的L929細(xì)胞，經(jīng)消化后調(diào)整為濃度為5×105個/ml的細(xì)胞懸液，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2 ml。培養(yǎng)24 h后，分別設(shè)陰性對照組及雜質(zhì)A低、中、高濃度組，每組3個復(fù)孔。棄去原培養(yǎng)液，陰性對照組加入10% FBS-RPMI 1640，雜質(zhì)A低、中、高濃度組分別加入2.5、5和10 mg/ml的雜質(zhì)A溶液，每孔2 ml，置CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。16 h后，收集細(xì)胞以PBS洗滌2次，用Annexin-binding緩沖液調(diào)整為濃度為1×106個/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl細(xì)胞懸液先后加入Annexin V-FITC及PI抗體避光染色15 min，各管加入400 μl Annexin-binding緩沖液，混勻后以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測[7]。

表1 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)

1.5.3 對L929細(xì)胞周期的影響 采用PI法測定細(xì)胞周期，細(xì)胞接種、分組及給藥方法同“1.5.2”項(xiàng)。16 h后，收集細(xì)胞以PBS洗滌2次，離心取上清液，-20 ℃預(yù)冷70%乙醇固定過夜。離心去除乙醇，PBS洗滌2次后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/ml，再次離心后各管加入0.5 ml FxCycleTM PI/RNAse Staining Solution避光染色20 min，混勻后以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測[8]。

2 結(jié)果

2.1 雜質(zhì)A對L929細(xì)胞的毒性作用 與細(xì)胞作用24 h，形態(tài)學(xué)觀察顯示：陰性對照組細(xì)胞貼壁生長狀態(tài)良好，細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)內(nèi)含大量顆粒狀物質(zhì)，折光性減弱。雜質(zhì)A與L929細(xì)胞作用后，細(xì)胞數(shù)量降低，由梭形變?yōu)閳A形，空泡化嚴(yán)重，折光性變強(qiáng)。見圖2和表2。MTT法檢測顯示：雜質(zhì)A中、高濃度組具有明顯的細(xì)胞毒性。見圖3。與細(xì)胞作用48 h，形態(tài)學(xué)觀察顯示：陰性對照組細(xì)胞數(shù)量增加，貼壁生長狀態(tài)良好。雜質(zhì)A處理組細(xì)胞大量死亡，剩余細(xì)胞呈圓形皺縮，貼壁生長狀態(tài)不佳。見圖2和表2。MTT法檢測表明：雜質(zhì)A低、中、高濃度組具有明顯的細(xì)胞毒性，與陰性對照組相比，具有極顯著性差異(P<0.01)，且呈一定的濃度依賴性。見圖3。

圖2 不同濃度雜質(zhì)A作用24和48 h后L929細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

表2 雜質(zhì)A與細(xì)胞接觸 24和48 h后形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

圖3 不同濃度雜質(zhì)A作用

2.2 雜質(zhì)A對L929細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞培養(yǎng)16 h后檢測，陰性對照組L929細(xì)胞早期凋亡率(Annexin V單陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率)為5.65%，總凋亡率(Annexin V及PI雙陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比)為9.24%，雜質(zhì)A 2.5、5和10 mg/ml組早期凋亡率分別為11.26%、21.13%和38.37%，總凋亡率分別為14.33%、25.06%和48.83%，各濃度組均能明顯誘導(dǎo)L929細(xì)胞凋亡。見圖4。

2.3 雜質(zhì)A對L929細(xì)胞周期的影響 與細(xì)胞作用16 h后，5 mg/ml雜質(zhì)A明顯延長G0/G1期(P<0.01)，10 mg/ml雜質(zhì)A顯著延長G0/G1期(P<0.01)，明顯縮短S期(P<0.05)及G2/M期(P<0.01)，提示雜質(zhì)A可將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。見表3。

表3 雜質(zhì)A對L929細(xì)胞周期的影響

與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖4 雜質(zhì)A對L929細(xì)胞的凋亡作用

3 討論

藥品中的雜質(zhì)可概括為有機(jī)雜質(zhì)、無機(jī)雜質(zhì)和殘留試劑3類，通常將藥物有機(jī)雜質(zhì)的種類及含量稱為雜質(zhì)譜[9]。針對藥品中的每一個雜質(zhì)，依據(jù)其毒性反應(yīng)制定相應(yīng)的質(zhì)量控制限度，是雜質(zhì)譜控制的理想方法[10]。近年來，中國食品藥品檢定研究院每年組織全國的藥檢機(jī)構(gòu)進(jìn)行藥品的國家評價性抽驗(yàn)，使多種藥物的雜質(zhì)譜被闡明，有效促進(jìn)了產(chǎn)品工藝的改進(jìn)，推動了上市藥品質(zhì)量的整體提高[11]。

?；撬崾?017年國家評價性抽驗(yàn)品種之一，理化檢測中發(fā)現(xiàn)了藥品中雜質(zhì)2,2’-亞氨基二(乙烷磺酸)二鈉的存在，其在雜質(zhì)譜中含量最大，最高時達(dá)產(chǎn)品量1%以上。藥品中雜質(zhì)主要來源于兩種途徑，一是工藝雜質(zhì)，即從工藝過程中引入的雜質(zhì)；二是降解產(chǎn)物，即是藥物降解產(chǎn)生的雜質(zhì)。雜質(zhì)A為主成分生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，屬于工藝雜質(zhì)[12]。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未找到雜質(zhì)A相關(guān)的毒性研究資料[13]。試驗(yàn)研究結(jié)果表明，雜質(zhì)A具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，且能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，而文獻(xiàn)資料表明，藥物主成分?；撬崮軌蛎黠@保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、降低心肌細(xì)胞凋亡率[14，15]，可見雜質(zhì)A與藥物主成分藥理活性不一致。因此，雜質(zhì)A的存在有可能會降低藥品的質(zhì)量效果，應(yīng)引起關(guān)注。至于雜質(zhì)A是否會引發(fā)安全性隱患，是否需要實(shí)行嚴(yán)格的限度控制，尚需遺傳毒性等試驗(yàn)進(jìn)一步探索研究。