馬孫強(qiáng)， 馬 成， 李濟(jì)宇

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院普外科，上海 200072； 2. 安徽醫(yī)科大學(xué)上海臨床學(xué)院，上海 200072)

結(jié)直腸癌作為最常見的消化道惡性腫瘤之一，2012年全世界新增結(jié)直腸癌患者140萬，約70萬患者死于結(jié)直腸癌[1-2]。在我國，結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年升高，在男性和女性中分別成為發(fā)病率居第3位和第2位的惡性腫瘤[3]。以往的研究[4-5]表明，結(jié)直腸癌組織中肥大細(xì)胞的數(shù)目較多，且與腫瘤的分期和預(yù)后有關(guān)。但是結(jié)直腸癌組織中肥大細(xì)胞數(shù)目增多的機(jī)制還不是很清楚，因此探索被募集至腫瘤組織的肥大細(xì)胞數(shù)目增多的機(jī)制對進(jìn)一步理解結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。Fang等[6]研究表明，結(jié)直腸癌組織中IL-33的表達(dá)增加。同時(shí)之前的研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，骨髓來源肥大細(xì)胞(bone marrow-derived mast cell, BMMC)表面表達(dá)IL-33的受體ST2。由此，本研究旨在探討被募集至結(jié)直腸癌組織的肥大細(xì)胞是否是通過腫瘤組織高表達(dá)的IL-33作用于肥大細(xì)胞表面的ST2受體這一IL-33/ST2軸來實(shí)現(xiàn)的，以及是否被活化產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，從而促進(jìn)了結(jié)直腸癌的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 一般資料

15組結(jié)直腸癌及其相應(yīng)的癌旁組織切片和患者信息由同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院病理科提供，已獲得患者的知情同意。以上病例均無其他惡性腫瘤病史，臨床資料和病理資料完整。

1.2 細(xì)胞及主要試劑

肥大細(xì)胞株HMC-1、LAD2和人結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD-1、LoVo均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。Boyden遷移小室購自美國Costar公司(貨號(hào)： 3422)；TRIzol購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)： RR037A)、PCR試劑盒(貨號(hào)： AA4701A)購自日本TaKaRa公司；抗ST2抗體(貨號(hào)： ab25877)、抗IL-33抗體(貨號(hào)： ab54385)和sST2(貨號(hào)： ab219662)購自美國Abcam公司，TPSAB1抗體(貨號(hào)： 13343-1-AP)購自美國Proteintech公司。

1.3 方法

1.3.1 組織免疫熒光染色檢測腫瘤標(biāo)本中肥大細(xì)胞以及IL-33的表達(dá) 每組腫瘤組和癌旁組內(nèi)每張切片隨機(jī)截取3個(gè)200倍視野。盡量讓組織充滿整個(gè)視野，保證每張照片的背景光一致。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA)，選取相同的綠色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(integral optical density, IOD)。

1.3.2 細(xì)胞免疫熒光檢測ST2的表達(dá) 用含有10%的胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基將肥大細(xì)胞均勻鋪在共聚焦皿上，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，以備第2天使用。將前1天鋪有肥大細(xì)胞的共聚焦皿從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，用PBS輕輕沖洗2次，經(jīng)4%甲醛固定，BSA封閉，一抗二抗孵育后，滴加抗猝滅劑后熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 條件培養(yǎng)基(conditioned media)的制備 人結(jié)腸癌細(xì)胞株用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待正常培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿，去除培養(yǎng)液，換成無血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，收集上清液離心過濾即得條件培養(yǎng)基。

1.3.4 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)采用8μm孔徑24孔Boyden遷移小室，將3×104LAD2細(xì)胞重懸于200μL無血清RPMI 1640加入上室，下室分別加入500μL各實(shí)驗(yàn)組別培養(yǎng)基(IL-33組、DLD-1-CM組和LoVo-CM組)。放入37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，14h后取出小室，通過固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)目。

1.3.5 細(xì)胞總RNA的提取以及RT-qPCR檢測 按照TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,根據(jù)PCR試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR檢測，在ABI Prism 7500系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，采用相對定量法(2-ΔΔCt)進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系為20μL，擴(kuò)增條件： 95℃ 5min變性，95℃ 30s,55℃ 30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 5min。所用引物序列見表1。

1.3.6 Western印跡法檢測 收集待檢測細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白。按照BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。100℃，10min高溫變性，加入6×蛋白上樣緩沖液。經(jīng)過10% SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，10%脫脂牛奶室溫封閉1h，一抗孵育過夜，TBST清洗5min，共6次，二抗37℃孵育1h，TBST清洗5min，共3次，然后暗室曝光顯影。

表1 引物序列Tab.1 Sequence for primers

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌組織中，肥大細(xì)胞數(shù)目和IL-33含量增加

研究[9]發(fā)現(xiàn)，分布在皮膚、腸黏膜的肥大細(xì)胞表達(dá)類胰蛋白酶(tryptase)，可以作為肥大細(xì)胞的標(biāo)記蛋白。免疫熒光結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌旁組織和癌組織的肥大細(xì)胞數(shù)量分別為(26.26±15.35)和(73.29±33.44)個(gè)，與癌旁組織相比，結(jié)直腸癌組織的肥大細(xì)胞數(shù)量明顯多于癌旁組織(P<0.001)，見圖1A、B；腫瘤組織中的IL-33含量顯著高于癌旁組織(P<0.001)，見圖1C、D。

圖1 組織免疫熒光檢測結(jié)腸癌組織和癌旁組織的肥大細(xì)胞數(shù)目和IL-33表達(dá)情況Fig.1 Immunofluorescence staining was performed to determine the number of MCs infiltrated in CRC or adjacent tissues and the expression of IL-33A： 免疫熒光檢測結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的肥大細(xì)胞表達(dá)情況；B： 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)直腸癌組織及癌旁組織肥大細(xì)胞數(shù)目；C： 免疫熒光檢測結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的IL-33表達(dá)情況；D： 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)直腸癌組織及癌旁組織IL-33的表達(dá)量；與癌旁組織相比，*P<0.001

2.2 肥大細(xì)胞表達(dá)IL-33的受體ST2

為了驗(yàn)證結(jié)腸癌組織中浸潤的肥大細(xì)胞可能是通過IL-33/ST2軸被募集過來的，本研究通過細(xì)胞免疫熒光和Western印跡法檢測肥大細(xì)胞株HMC-1和LAD-2的ST2的表達(dá)情況。細(xì)胞免疫熒光顯示，ST2在胞膜和胞質(zhì)中呈現(xiàn)綠色熒光，提示ST2表達(dá)于肥大細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)，見圖2A、B。Western印跡法結(jié)果顯示，HMC-1和LAD-2均表達(dá)ST2，見圖2C。

2.3 IL-33/ST2軸在肥大細(xì)胞招募中的作用

為了驗(yàn)證IL-33在腫瘤組織招募肥大細(xì)胞的過程起作用，本次研究做了Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，添加IL-33、DLD-1-CM和LoVo-CM的肥大細(xì)胞相比空白對照組遷移能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，而上述3組在添加IL-33抑制劑sST2后，肥大細(xì)胞的遷移能力又明顯減弱(P<0.01)，見圖3。上述結(jié)果提示加入IL-33抑制劑sST2后，肥大細(xì)胞的遷移能力相比對照組減弱，說明IL-33可能在腫瘤組織招募肥大細(xì)胞的過程中起著重要的作用，并且是通過IL-33/ST2軸來實(shí)現(xiàn)的。

圖2 細(xì)胞免疫熒光和Western印跡法檢測肥大細(xì)胞表面ST2的表達(dá)Fig.2 Immunofluorescence and Western blotting were performed to detect ST2 expression on mast cellsA： HMC-1細(xì)胞；B： LAD2細(xì)胞；C： Western 印跡法檢測

圖3 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測肥大細(xì)胞遷移能力的變化Fig.3 Transwell assay was performed in MCsA： 從左到右的下層小室培養(yǎng)基分別是： 無血清RPMI 1640，無血清RPMI 1640+IL-33(10ng/mL)，DLD-1-CM，LoVo-CM;B： 分別將A圖四組中加入IL-33抑制劑sST2(10ng/mL); C: 遷移能力比較；與NC組相比，*P<0.05，**P<0.01，與末加入sST2時(shí)相比，#P<0.05，##P<0.01

2.4 腫瘤細(xì)胞對招募的肥大細(xì)胞的影響

為了進(jìn)一步研究肥大細(xì)胞在通過IL-33/ST2軸被募集至腫瘤組織后是否被活化，將肥大細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，利用細(xì)胞的貼壁能力的差異將肥大細(xì)胞分離出后，分別于第0、2、4、8、12、24小時(shí)在mRNA水平檢測肥大細(xì)胞細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10和GM-CSF的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)后的肥大細(xì)胞表達(dá)IL-4、IL-6、IL-10和GM-CSF轉(zhuǎn)錄水平明顯增加，其中IL-4和GM-CSF轉(zhuǎn)錄水平在8h上升最顯著，IL-4是對照組的(13.71±1.57)倍(P=0.012)，GM-CSF是對照組的(6.46±1.25)倍(P<0.01)；IL-6在24h表達(dá)水平最高，是對照組的(4.55±0.06)倍(P<0.01)；IL-10在4h表達(dá)水平上升最顯著，是對照組的(6.44±0.65)倍(P<0.01)，見圖4。

圖4 與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)的肥大細(xì)胞活化產(chǎn)生多種細(xì)胞因子Fig.4 Mast cells co-cultured with colon cancer cells activated to produce multiple cytokinesA： IL-4; B： IL-6; C： IL-10; D： GM-CSF；與NC組相比，*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也被認(rèn)為是其免疫治療成敗的關(guān)鍵[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌在發(fā)生發(fā)展過程中能夠大量表達(dá)IL-33，并能夠通過該途徑募集肥大細(xì)胞至腫瘤組織中。肥大細(xì)胞作為組織駐留的崗哨細(xì)胞，廣泛存在于與外界相通的結(jié)直腸中。本次研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞與CRC細(xì)胞共培養(yǎng)后，MC表達(dá)IL-4、IL-6、IL-10和GM-CSF等多種與其生長相關(guān)的細(xì)胞因子，這為肥大細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮其免疫學(xué)作用提供了重要的支撐。

肥大細(xì)胞起源于CD34+、CD13+、c-kit+的造血干細(xì)胞，并遷移到周圍組織中完成其分化成熟過程，此后依據(jù)特定免疫刺激而發(fā)揮相應(yīng)功能[11]。近年研究[12]發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞并不僅僅局限于在抗寄生蟲和過敏反應(yīng)中的主導(dǎo)作用，其與腫瘤關(guān)系也日益受到重視[9,12-14]。腫瘤浸潤骨髓細(xì)胞在腫瘤的生長中發(fā)揮積極作用，肥大細(xì)胞是一個(gè)最早的浸潤腫瘤的細(xì)胞類型[15]。肥大細(xì)胞通常積聚在正常組織和惡性腫瘤的連接區(qū),在腫瘤微環(huán)境血管生成,細(xì)胞毒性作用介導(dǎo)以及組織重塑中均發(fā)揮重要作用[16]。本實(shí)驗(yàn)通過利用15組結(jié)直腸癌及其相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本,證實(shí)肥大細(xì)胞在腫瘤組織中廣泛浸潤。既往研究中,Strouch等[9]通過對53組人胰腺癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中的肥大細(xì)胞數(shù)目顯著高于鄰近癌旁組織，并且肥大細(xì)胞的浸潤與患者的不良預(yù)后存在著關(guān)聯(lián)；Melillo等[13]對96例甲狀腺癌組織和14例正常甲狀腺組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞僅存在于癌組織中，13例正常甲狀腺組織中僅有1例少量浸潤，并且高表達(dá)肥大細(xì)胞的甲狀腺癌患者發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高。這些均和本次研究結(jié)果一致,然而肥大細(xì)胞是如何浸潤于腫瘤組織中還有待進(jìn)一步明確。

發(fā)展中的腫瘤細(xì)胞可以釋放出多種促進(jìn)免疫細(xì)胞募集的細(xì)胞因子[17]，而IL-33是一種多功能細(xì)胞因子,在介導(dǎo)2型輔助性T細(xì)胞(helper T cell 2, Th2) 型和固有淋巴細(xì)胞2(innate lymphoid cell 2, ILC2)免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)IL-33同樣在結(jié)直腸癌腫瘤組織中高表達(dá)，且與肥大細(xì)胞的分布和豐度高度一致。肥大細(xì)胞作為介導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞類型，并高表達(dá)IL-33的受體ST2,通過體外細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以添加IL-33為陽性對照組，在含DLD-1-CM和LoVo-CM的肥大細(xì)胞中,相比空白對照組其遷移能力顯著增強(qiáng)，提示結(jié)腸癌細(xì)胞可通過產(chǎn)生特定細(xì)胞因子促進(jìn)肥大細(xì)胞遷移；進(jìn)一步加入IL-33受體抑制劑sST2后，肥大細(xì)胞的遷移能力有顯著下降，證明結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的IL-33在肥大細(xì)胞遷移中起著重要的作用。值得一提的是,之前有研究[19]表明，IL-33在介導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移進(jìn)而加重類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中同樣發(fā)揮重要作用。Fang等[6]也證實(shí)IL-33通過招募巨噬細(xì)胞促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞干細(xì)胞干性的表達(dá)。

IL-33/ST2軸不僅能夠觸發(fā)Th2型免疫,研究表明它還能通過上調(diào)抗凋亡分子(B-cell lymphoma-X large, BCLXL)維持人皮膚來源和小鼠骨髓來源肥大細(xì)胞的生長[20]。本研究將肥大細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)后的肥大細(xì)胞中IL-4、IL-6、IL-10和GM-CSF轉(zhuǎn)錄水平明顯增加,這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)肥大細(xì)胞的生存生長[8,21-22]。

綜上，本研究證明了結(jié)直腸癌組織通過產(chǎn)生IL-33作用于肥大細(xì)胞表面的ST2受體將其募集至腫瘤部位，為結(jié)直腸癌中肥大細(xì)胞的浸潤機(jī)制提供了重要的思路，為完善結(jié)直腸癌的治療提供了新的理論基礎(chǔ)。