祁珊珊 雒志恒 馮自立 龔帥 何佳 郝少陽(yáng) 李婉

陜西理工大學(xué)維生素D生理與應(yīng)用研究所，陜西 漢中 723000

婦女絕經(jīng)后因卵巢功能下降、雌激素水平驟降，體內(nèi)骨轉(zhuǎn)換率顯著加快，骨吸收的速度超過(guò)骨形成的速度，導(dǎo)致骨量丟失、骨密度下降、骨骼脆性增加引起的骨質(zhì)疏松癥稱(chēng)為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)[1]。組織學(xué)和組織化學(xué)研究表明破骨細(xì)胞活動(dòng)和骨吸收增加與骨髓肥大細(xì)胞增殖有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)老年性骨質(zhì)疏松患者骨髓肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增加[2-3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增生癥也會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[4-6]。然而上述研究?jī)H限于對(duì)老年性骨質(zhì)疏松癥患者骨髓肥大細(xì)胞的觀察，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是否也伴隨骨髓肥大細(xì)胞的增生，骨髓肥大細(xì)胞增生是否可以成為骨質(zhì)疏松診斷和治療的依據(jù)？本研究以去卵巢大鼠為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松疾病模型，觀察和計(jì)數(shù)肥大細(xì)胞在骨質(zhì)疏松大鼠骨組織中的分布，探討肥大細(xì)胞作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥診斷和治療依據(jù)的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性12 w齡未孕SD大鼠20只，體重(245±33)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(軍)2012-0007]。所有動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

大鼠雌二醇(estradiol，E2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand ，RANKL)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。儀器主要有酶標(biāo)儀(Biotek)、石蠟組織切片機(jī)(Leica RM2235)、倒置熒光顯微鏡(Nikon)、計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(Image pro plus 6.0)。

1.3 卵巢去除手術(shù)

將20只SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)和去卵巢組(OVX組)，其中Sham組10只，OVX組10只。OVX組大鼠參考筆者先前報(bào)道的方法實(shí)施卵巢去除手術(shù)[7]。Sham組大鼠實(shí)施假手術(shù)，術(shù)后1 w對(duì)OVX組大鼠進(jìn)行陰道涂片，連續(xù)涂片觀察5 d，去卵巢組不出現(xiàn)動(dòng)情周期，表明卵巢去除成功。

1.4 血液樣本采集和分析

去除卵巢后3個(gè)月，所有大鼠CO2麻醉后眼眶靜脈采血，離心收集血清，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)血清E2、ALP、OPG、RANKL含量，檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 骨組織樣本采集

采血結(jié)束后，取股骨近端干骺端、脛骨近端干骺端放入3.7%的多聚甲醛溶液中固定24 h，流水沖洗后置于10%的EDTA緩沖溶液(pH 8.0)中進(jìn)行脫鈣(脫鈣時(shí)間約為20 d左右)。

1.6 骨組織肥大細(xì)胞染色觀察

脫鈣結(jié)束后，對(duì)骨組織樣本進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋、切片(5 μm)，改良甲苯胺藍(lán)染色，95%的酒精分化，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡觀察骨組織肥大細(xì)胞的分布。

1.7 肥大細(xì)胞的計(jì)數(shù)

每個(gè)骨組織樣本每隔 5張連續(xù)切片計(jì)數(shù)一張，共計(jì)5張，低倍鏡下(10× 10)計(jì)數(shù)每張骨組織切片中所有肥大細(xì)胞，并求 5張切片肥大細(xì)胞的均數(shù)，據(jù)此求得各組肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素組間方差分析和比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清E2、ALP、OPG、RANKL檢測(cè)結(jié)果

大鼠血清 E2、ALP、OPG、RANKL檢測(cè)結(jié)果如表1所示，大鼠卵巢去除后3個(gè)月，血清E2、OPG含量較Sham組顯著降低(P<0.01)，ALP和RANKL的含量較Sham組顯著增加(P<0.01)，血清生化指標(biāo)證實(shí)大鼠卵巢去除后3個(gè)月呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀。

表1 兩組大鼠血清骨代謝生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of serum biochemical markers of bone metabolism in rats of the two n=10)

2.2 骨肥大細(xì)胞的分布及形態(tài)

大鼠骨肥大細(xì)胞的分布基本一致，肥大細(xì)胞呈圓形、橢圓形或梭形，胞漿內(nèi)充滿(mǎn)紫紅色的異染性顆粒，并存在脫顆?，F(xiàn)象，散在分布于骨組織中，其在脛骨、股骨組織中的分布均集中于骨髓腔，在骨小梁中無(wú)肥大細(xì)胞分布(圖1)。

圖1 肥大細(xì)胞在大鼠骨組織中的分布。A：Sham組大鼠脛骨干骺端肥大細(xì)胞(甲苯胺藍(lán) 400×)；B：OVX組大鼠脛骨干骺端肥大細(xì)胞(甲苯胺藍(lán) 400×)；C：Sham組大鼠股骨干骺端肥大細(xì)胞(甲苯胺藍(lán) 400×)；D：OVX組大鼠股骨干骺端肥大細(xì)胞(甲苯胺藍(lán) 400×)；箭頭所示為肥大細(xì)胞Fig.1 Distribution of mast cells in bone tissue of rats. A: Mast cells in the tibial metaphysis of Sham rats (toluidine blue, 400×); B: Mast cells in the tibia metaphysis of OVX rats (toluidine blue, 400×); C: Mast cells in the femoral metaphysis of Sham rats (toluidine blue, 400×); D: Mast cells in the femoral metaphysis of OVX rats (toluidine blue, 400×). The mast cells are shown in the arrow.

2.3 去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織肥大細(xì)胞數(shù)量變化

大鼠卵巢摘除后，股骨、脛骨干骺端肥大細(xì)胞的數(shù)量較Sham組明顯增多，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。OVX組大鼠骨組織肥大細(xì)胞數(shù)量約為Sham組的5倍，上述變化表明，大鼠卵巢去除后隨著體內(nèi)雌激素水平的降低，骨組織肥大細(xì)胞數(shù)量呈遞增趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠脛骨干骺端、股骨干骺端橫斷面全層肥大細(xì)胞數(shù)量比較Table 2 Comparison of the number of mast cells in cross-sectional layer of the tibia metaphysis and femoral metaphyseal between two n=10)

3 討論

PMOP是一種與衰老相關(guān)的內(nèi)分泌疾病，主要發(fā)生在絕經(jīng)后婦女，由于絕經(jīng)后雌激素缺乏導(dǎo)致骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)變化，使骨脆性增加，骨折發(fā)生率增加，絕經(jīng)后婦女發(fā)生骨質(zhì)疏松的患病率約為男性的4倍[1]。組織化學(xué)研究表明破骨細(xì)胞活動(dòng)和骨吸收增加與骨髓肥大細(xì)胞增殖有關(guān)，1968年Frame最早運(yùn)用組織化學(xué)的方法觀察和計(jì)數(shù)了老年性骨質(zhì)疏松患者骨髓肥大細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)老年性骨質(zhì)疏松患者骨髓肥大細(xì)胞增生[8]，這個(gè)發(fā)現(xiàn)在1981年被Fallon等人[9]證實(shí)，他們的研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞主要分布在松質(zhì)骨而非皮質(zhì)骨，且在松質(zhì)骨骨髓腔中分布，這與本研究結(jié)果一致。雖然肥大細(xì)胞與老年性骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系提出較早，但肥大細(xì)胞與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是否也有聯(lián)系，這方面無(wú)人研究。

本研究發(fā)現(xiàn)3月齡大鼠去除卵巢后3個(gè)月呈現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松癥狀，主要表現(xiàn)在血清雌二醇含量急劇降低，血清ALP、RANKL含量急劇增加，血清OPG含量降低，筆者先前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在對(duì)骨組織形態(tài)學(xué)等方面的研究證實(shí)3月齡大鼠去除卵巢后3個(gè)月骨小梁面積百分比、骨小梁厚度等均顯著降低[10]。本研究通過(guò)對(duì)脛骨干骺端、股骨干骺端組織切片肥大細(xì)胞的染色和計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)OVX大鼠脛骨干骺端、股骨干骺端肥大細(xì)胞數(shù)量較Sham組顯著增加，OVX組脛骨、股骨骨髓腔肥大細(xì)胞數(shù)量約為Sham組的5倍，且肥大細(xì)胞主要分布在骨髓腔中，肥大細(xì)胞的形態(tài)區(qū)別不大。筆者前期在對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠子宮肥大細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠卵巢去除后子宮肥大細(xì)胞數(shù)量也較Sham組顯著增加，給藥雌激素治療28 d后OVX組大鼠子宮肥大細(xì)胞數(shù)量又明顯降低[11]。Narita等[12]的研究認(rèn)為，雌激素可使肥大脫顆粒，甚至細(xì)胞崩解，高濃度雌激素使肥大脫顆粒，導(dǎo)致其數(shù)量減少。

很多研究表明肥大細(xì)胞與骨重塑之間有密切聯(lián)系，在鈣缺乏大鼠骨組織中肥大細(xì)胞數(shù)量顯著增加[13-14]。肥大細(xì)胞含有肝素和血管活性物質(zhì)，肥大細(xì)胞內(nèi)的顆粒含肝素或肝素前體，當(dāng)遇到物理或化學(xué)刺激可促使肥大細(xì)胞脫顆粒，此時(shí)肝素被釋出，研究發(fā)現(xiàn)肝素與骨吸收息息相關(guān)，Goldhaber[15]的研究發(fā)現(xiàn)肝素可以促進(jìn)骨吸收，給兔子注射肝素后其發(fā)生自發(fā)性骨折的概率顯著增加。Relea等[16]的研究認(rèn)為鋅對(duì)骨的代謝和支持起很重要的作用，鋅可直接影響骨骼發(fā)育，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，其主要作用機(jī)制是鋅具有穩(wěn)定肥大細(xì)胞和抑制內(nèi)源性肝素顆粒釋放的作用。

本實(shí)驗(yàn)所發(fā)現(xiàn)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨髓腔肥大細(xì)胞增生進(jìn)一步證實(shí)肥大細(xì)胞在骨重塑中具有重要意義，對(duì)了解肥大細(xì)胞在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的功能具有一定意義，也為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療提供了一個(gè)新靶標(biāo)。