周孟 李芮 鄧連力 張榮紅 李勇軍 王永林 鞏仔鵬

摘 要 目的：建立同時測定黔產(chǎn)澤漆中沒食子酸、原兒茶酸和金絲桃苷含量的方法，為澤漆藥材及其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定基礎(chǔ)。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法。色譜柱為X-brige C18；流動相為乙腈-1%乙酸溶液（梯度洗脫）；沒食子酸、原兒茶酸和金絲桃苷檢測波長分別為271、259、256 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；進(jìn)樣體積為10 μL。結(jié)果：沒食子酸、原兒茶酸和金絲桃苷的進(jìn)樣量線性范圍分別為0.005 6～0.089 6、0.003 6～0.057 3、0.017 2～0.275 5 mg/mL（R2分別為0.999 9、0.999 7、1.000 0），檢測限分別為31.43、39.64、49.05 ng/mL，定量限分別為78.58、99.10、122.63 ng/mL，精密度（n=6）、穩(wěn)定性（n=6）、重復(fù)性（n=9）試驗的RSD均小于3.0%，回收率為100.24%～101.64%（RSD小于2.0%，n=9）。結(jié)論：本研究建立的HPLC法簡便、準(zhǔn)確，適用于黔產(chǎn)澤漆中沒食子酸、原兒茶酸和金絲桃苷含量的同時測定。

關(guān)鍵詞 黔產(chǎn)澤漆；高效液相色譜法；含量測定；多波長

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）21-2958-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.21.18

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the simultaneous determination of gallic acid， protocatechuic acid and hyperin in Euphorbia helioscopia from Guizhou， and to lay a foundation for the formulation of quality standard of E. helioscopia and its related products. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on X-brige C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-1%glacial acetic acid （gradient elution） at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelengths were set at 271 nm， 259 nm and 256 nm for gallic acid， protocatechuic acid and hyperoside， respectively. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range of gallic acid， protocatechuic acid and hyperoside were 0.005 6-0.089 6 （R2=0.999 9）， 0.003 6-0.057 3 （R2=0.999 7） and 0.017 2-0.275 5 mg/mL （R2=1.000 0）， respectively. The detection limits were 31.43， 39.64， 49.05 ng/mL， respectively. The quantitation limits were 78.58， 99.10， 122.63 ng/mL， respectively. RSDs of precision （n=6）， stability （n=6） and reproducibility （n=9） tests were all lower than 3.0%. The sample recovery rates were 100.24%-101.64% （RSDs<2.0%， n=9）. CONCLUSIONS： The developed HPLC method is simple， accurate and suitable for the simultaneous determination of gallic acid， protocatechuic acid and hyperin in E. helioscopia from Guizhou.

KEYWORDS Euphorbia helioscopia from Guizhou； HPLC； Content determination； Multi-wavelength

澤漆（Euphorbia helioscopia L.）為大戟科大戟屬植物，又名貓眼草、五朵云及五燈頭，為民間常用中草藥，分布廣泛[1]。澤漆在臨床上可用于結(jié)核性瘺管、細(xì)菌性痢疾、食道癌、無黃疸型傳染性肝炎等疾病的治療[2]。此外，大量的實驗研究和臨床實踐證實，澤漆的抗腫瘤作用明顯，是一味具有較高研究和開發(fā)價值的藥材[3]。澤漆中的許多成分均顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性[4]，澤漆單用或與其他中藥配伍使用治療肺癌[5]、食管癌[6]等多種惡性腫瘤均有效。楊莉等[7]從澤漆中提取并鑒定出了沒食子酸、金絲桃苷等化合物，并證實沒食子酸和金絲桃苷在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，對小鼠肺腺癌細(xì)胞LA795的生長活性抑制率分別達(dá)到了93.29%和90.34%。然而，目前關(guān)于澤漆的質(zhì)量控制研究較少，只有關(guān)于渝產(chǎn)澤漆中酚酸類物質(zhì)和總黃酮含量的研究[8-9]，可供參考內(nèi)容較少。因此，本研究擬對黔產(chǎn)澤漆中具有抗腫瘤作用的沒食子酸和金絲桃苷以及具有顯著抑菌作用的原兒茶酸[10]這3個活性成分進(jìn)行含量分析，以期為完善澤漆藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)，同時為黔產(chǎn)澤漆資源的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY 2998高效液相色譜（HPLC）儀（包括輸液泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、光電二極管陣列檢測器）購自沃特世科技（上海）有限公司；AE240十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；WP-UP- IV-20超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥品與試劑

所有澤漆藥材樣品均經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與藥用植物學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為大戟科草本植物澤漆（E. helioscopia L.）的全草，用前粉碎，過60目篩，混合均勻；原兒茶酸對照品（批號：110809-201205，純度：99.9%）、沒食子酸對照品（批號：110831-201605，純度：90.8%）和金絲桃苷對照品（批號：111521-201507，純度：94.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈和醋酸為色譜純，水為超純水。澤漆藥材的樣品信息詳見表1

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 分別精密稱取沒食子酸對照品3.58 mg、原兒茶酸對照品2.29 mg和金絲桃苷對照品10.02 mg，置于同一5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，作為混合對照品母液。取混合對照品母液0.5 mL，置于2 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，制備成沒食子酸、原兒茶酸和金絲桃苷質(zhì)量濃度分別為0.179 2、0.114 5、0.551 0 mg/mL的混合對照品原液。然后采用2倍稀釋法將混合對照品原液稀釋，獲得5個質(zhì)量濃度的系列對照品溶液，沒食子酸、原兒茶酸與金絲桃苷對照品的最大質(zhì)量濃度分別為0.089 6、0.057 3、0.275 5 mg/mL。

2.1.2 供試品溶液 取澤漆藥材粉末樣品（批號：1608- 16-3）約1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過。取適量續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，置于進(jìn)樣瓶中，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：X-brige C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-1%乙酸溶液（B），梯度洗脫（0～3 min，2%～5%A；3～8 min，5%A；8～9 min，5%～14%A；9～20 min，14%A）；檢測波長：271 nm（沒食子酸）、259 nm（原兒茶酸）、256 nm（金絲桃苷）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取澤漆藥材粉末樣品（批號：160816-3）1份，按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液；取“2.1.1”項下混合對照品原液，稀釋成沒食子酸、原兒茶酸、金絲桃苷質(zhì)量濃度分別為0.022 4、0.014 3、0.068 9 mg/mL的混合對照品溶液。將2種溶液按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果，混合對照品溶液與供試品溶液中3種檢測指標(biāo)成分均達(dá)到基線分離，沒食子酸、原兒茶酸和金絲桃苷各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于2，理論板數(shù)以沒食子酸計不低于3 000。色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.1.1”項下5個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，分別按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得到?jīng)]食子酸、原兒茶酸、金絲桃苷3個化合物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

2.5 檢測限和定量限檢測

分別制備沒食子酸對照品溶液（0.491 1 mg/mL）、原兒茶酸對照品溶液（0.619 4 mg/mL）和金絲桃苷對照品溶液（0.766 4 mg/mL），分別用甲醇以25倍稀釋法不斷稀釋，當(dāng)信噪比為10～11得定量限，當(dāng)信噪比為3～4時得檢測限，測定結(jié)果見表2。

2.6 精密度試驗

取澤漆藥材粉末樣品（批號：160816-3）1份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、原兒茶酸、金絲桃苷峰面積的RSD分別為1.32%、0.42%、0.77%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取澤漆藥材粉末樣品（批號：160816-3）1份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別放置0、1、2、4、6、8 h后按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸、原兒茶酸、金絲桃苷峰面積的RSD分別為0.47%、0.74%、0.99%（n=6），表明供試品溶液在室溫條件下8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

分別取澤漆藥材粉末樣品（批號：160816-3）0.5、1、1.5 g，各3份，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品中3個成分的含量。結(jié)果，沒食子酸、原兒茶酸、金絲桃苷的平均含量分別為0.637 1、0.317 5、1.318 9 mg/g，RSD分別為2.03%、0.57%、1.26%（n=9），表明本法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收試驗

取澤漆藥材粉末樣品（批號：160816-3）約0.5 g，共3份，精密稱定，分別加入稱量樣品中被測定成分的本底含量為50%、100%、150%的對照品，然后按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，每個濃度平行制備3份，合計9份。然后分別按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸，原兒茶酸和金絲桃苷的回收率分別為100.24%、101.45%、101.64%，RSD分別為1.24%、1.12%、0.58%（n=9），均小于2.0%，表明本方法的準(zhǔn)確度較好，結(jié)果見表3。

2.10 樣品含量測定

取貴州不同產(chǎn)地的9批澤漆藥材粉末約1 g，各2份，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品中3個成分的含量。結(jié)果，貴州遵義市播州區(qū)楓香鎮(zhèn)茍壩村產(chǎn)澤漆（編號1）中沒食子酸和原兒茶酸含量最高，分別為0.660 2、0.761 6 mg/g，幾乎達(dá)到了多數(shù)產(chǎn)地含量的2倍；貴州安順市關(guān)嶺布依族苗族自治縣花江鎮(zhèn)產(chǎn)澤漆（編號2）中金絲桃苷含量最高，為6.666 1 mg/g；此外，貴州黔東南州從江縣谷坪鄉(xiāng)山崗村產(chǎn)澤漆（編號6）中的金絲桃苷也達(dá)到了6.438 5 mg/g，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 藥材提取溶劑的選擇

本研究選取澤漆中具有明顯藥理活性的沒食子酸、原兒茶酸和金絲桃苷作為含量測定的指標(biāo)。其中，沒食子酸和原兒茶酸皆為含有酚環(huán)的有機(jī)酸，沒食子酸易溶于熱水、甲醇、乙醇[11]，原兒茶酸可溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑；金絲桃苷又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，屬黃酮醇苷類化合物，易溶于乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑?？梢姡@3個成分在甲醇或乙醇等有機(jī)溶劑中均溶解度較高。同時，依據(jù)2015年版《中國藥典》（一部）（后文簡稱藥典）“野馬追”中金絲桃苷含量測定方法[12]，本研究分別考察了30%、50%、70%、90%甲醇作為提取溶劑對3個指標(biāo)成分提取率的影響，以確保3個指標(biāo)成分提取率最高。試驗發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷的提取率隨甲醇濃度的增加而增大，沒食子酸和原兒茶酸的提取率在甲醇濃度為70%時最高。因此，本研究最終確定以70%甲醇作為提取溶劑。

3.2 色譜條件的選擇

筆者在預(yù)試驗中分別考察了在不同流動相體系（甲醇-0.1%磷酸、甲醇-1%乙酸、乙腈-0.1%磷酸和乙腈-1%乙酸）、不同流速（0.8、1、1.2 mL/min）和不同柱溫（28、30、32 ℃）下，各指標(biāo)成分的分離度、峰形、保留時間等的變化，最終確定流動相為乙腈-1%乙酸、流速為1 mL/min、柱溫為30 ℃，此時各成分峰形好、分離度較好。另外，筆者在檢測過程中進(jìn)行190 ～ 400 nm波長范圍內(nèi)的全掃描，在不考慮有較大干擾的末端吸收下，沒食子酸的最大吸收與藥典規(guī)定一致，為271 nm；原兒茶酸的最大吸收波長與韓煜等[14]報道的一致，為259 nm；而黃酮類化合物金絲桃苷中由于存在桂皮?；氨郊柞；M成的交叉共軛體系，其甲醇溶液在200～400 nm波長區(qū)域內(nèi)存在2個主要的紫外吸收帶，即峰帶Ⅰ（300～400 nm）和峰帶Ⅱ（220～280 nm），故本研究在藥典基礎(chǔ)上通過比較金絲桃苷組分的峰面積，最終確定其最佳檢測波長為256 nm。

目前，澤漆在化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性方面的研究已經(jīng)取得了較為系統(tǒng)和深入的研究，其應(yīng)用研究方向主要包括殺蟲[15]、抗早期肝癌[16]等，具有巨大的市場潛力。然而，澤漆的活性物質(zhì)仍缺乏可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究建立了多波長HPLC法同時測定澤漆中具有抗腫瘤活性的沒食子酸、金絲桃苷及抗菌作用的原兒茶酸3個活性成分含量的方法，具有精確度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好以及簡便等特點。研究結(jié)果表明，來自貴州7個市9個不同產(chǎn)地的澤漆中均含有沒食子酸、原兒茶酸和金絲桃苷。其中，沒食子酸含量為0.287 4～0.660 2 mg/g；原兒茶酸含量為0.199 3～0.761 6 mg/g；金絲桃苷含量為1.302 5～ 6.666 1 mg/g。不同市區(qū)間的上述指標(biāo)成分含量差異明顯，即使是六盤水市兩個來源澤漆中沒食子酸和原兒茶酸含量間也有較大的差異，筆者推測這可能與采摘的日期和貴州特殊的氣候地貌有關(guān)。

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（收稿日期：2018-05-02 修回日期：2018-08-14）

（編輯：林 靜）