劉蓉芳 張輝 譚雄 袁倩 閆秋林 劉建和 胡志希 毛以林

〔摘要〕 目的 探討心康沖劑抗心衰大鼠心肌纖維化的機制。方法 90只SD大鼠分為正常組10只，模型組、對照組及心康低、中、高劑量組各16只。心康低、中、高劑量組分別給予0.5、1、2 g/（kg·d）的心康沖劑溶液。對照組給予0.06 g/（kg·d）的芪藶強心膠囊。正常組、模型組按1 mL/（kg·d）灌服生理鹽水。各組均每日1次，連續(xù)灌服8周。計算左心室質量指數(shù)（LVMI）；心臟切片行HE、Masson染色并計算膠原容積分數(shù)（CVF）；采用Real-time PCR法檢測miRNA-21、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）mRNA表達水平；用Pearson相關及Logistic多元線性回歸分析miRNA-21、PTEN mRNA、CVF與LVMI之間的相關性。結果 與正常組比，模型組大鼠心肌CVF、LVMI比值及miRNA-21表達升高（P<0.01），PTENmRNA表達下降（P<0.01）。與模型組比，心康低、中、高劑三組CVF、LVMI比值及miRNA-21表達下降（P<0.01）、PTENmRNA表達升高（P<0.01）；與芪藶強心組比較，心康沖劑低、中、高劑LVMI、CVF、miRNA-21、PTEN mRNA無明顯差異（P>0.05）。miRNA-21、PTENmRNA、CVF均與LVMI有明顯線性相關關系。結論 心康沖劑可通過下調miRNA-21、升高PTEN mRNA表達抗心肌纖維化。

〔關鍵詞〕 慢性心衰；心肌纖維化；微小RNA-21；人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因；心康沖劑

〔中圖分類號〕R285.5；R542.2+3 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.03.010

Effect of Xinkang Granule on Anti-Myocardial Fibrosis by Regulating miRNA-21/PTEN

in Rats with Chronic Heart Failure

LIU Rongfang1，2， ZHANG Hui2， TAN Xiong2， YUAN Qian2， YAN Qiulin2， LIU Jianhe3， HU Zhixi4， MAO Yilin2*

（1. Graduate School， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China； 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China； 3. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China； 4. Basic Medical College of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To explore the mechanism of Xinkang Granule on anti-myocardial fibrosis in rats with heart failure. Methods Ninety SD rats were randomly divided into normal group （n=10）， model group （n=16）， control group （n=16）， XKG low-dose group （n=16）， XKG middle-dose group （n=16）， XKG high-dose group （n=16）. Xinkang groups were given with 0.5， 1， 2 g/（kg·d） Xinkang granule solution. The control group was given with 0.06 g/（kg·d） Qiliqiangxin capsule （QLQXC）. Rats in the normal group and model control group were administrated with saline at 1 mL/（kg·d）. Every group was given corresponding medicine by gavage for 8 weeks， once daily. The left ventricular mass index（LVMI） was calculated. The slice of heart was stained by HE and Masson， and collagen volume fraction （CVF） of heart was caculated. The expression levels of miRNA-21， phosphatase and tensin homology gene deleted on chromosome ten （PTEN） were measured by Real-time PCR method. The correlations between miRNA-21， PTEN mRNA， CVF and LVMI were analyzed by Pearson correlation and Logistic multivariate linear regression. Results Compared with the normal group， CVF， LVMI and the expression of miRNA-21 in rats of the model group increased （P<0.01）， and PTEN mRNA down-regulated （P<0.01）. Compared with the model group， CVF， LVMI and the expression level of miRNA-21 in rats of Xinkang groups down-regulated （P<0.01）， and PTEN mRNA up-regulated（P<0.01）. Compared with QLQXC group， the LVMI， CVF， miRNA-21， PTEN mRNA in all Xinkang granule groups were not statistically significant （P>0.05）. MiRNA-21， PTEN mRNA and CVF showed obvious linear correlation with LVMI. Conclusion Xinkang granule showed anti-myocardial fibrosis effect by down-regulating miRNA-21 and increasing PTEN mRNA expression.

〔Keywords〕 chronic heart failure； myocardial fibrosis； miRNA-21； phosphatase and tensin homology gene deleted on chromosome ten； Xinkang granule

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是各種心臟病的嚴重階段及最終導致死亡最主要的原因[1]。心肌纖維化是心肌正常組織結構中膠原纖維過量積聚導致膠原濃度顯著升高或膠原成分發(fā)生改變的病理現(xiàn)象，是心功能不全的重要病理因素之一。心肌纖維化后出現(xiàn)心肌僵硬度增加、順應性減少，收縮力下降，最終導致心力衰竭。

微小RNA-21（microRNA-21，miRNA-21）在心臟表達豐富，其生理功能與心肌纖維化密切相關[2]。研究表明miRNA-21可抑制成纖維細胞凋亡，引起心肌肥大和心肌纖維化[3]。PTEN定位于人類第10號染色體[4]，是miRNA-21重要的的靶分子，通過調節(jié)轉錄后水平機制影響PTEN表達。研究發(fā)現(xiàn)PTEN在心肌纖維化病理過程中起重要作用。臨床抗心衰心肌纖維化主要是血管緊張素轉化酶抑制劑類或血管緊張素受體拮抗劑類，但很多患者不能耐受其副作用或者因禁忌癥而導致藥物停服。探討安全有效的中藥有利于指導臨床，增加中成藥臨床治療慢性心衰的使用，提高臨床療效。本文欲探討心康沖劑調控miRNA-21-PTEN抗心肌纖維化的機制，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠90只購于湖南斯克達實驗動物有限公司（實驗動物合格證號：43004700025095）。體質量（160±20） g，雌雄各半。

1.2 藥品及儀器

鹽酸阿霉素（深圳萬樂藥業(yè)有限公司），芪藶強心膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)），心康沖劑（湖南省中醫(yī)院中藥制劑室制備），引物（上海生工合成）。Motic B5顯微攝像圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪），OLYMPUS BX43型雙目生物攝像顯微鏡（日本），LEICA DM LB2型雙目顯微鏡（德國LEICA公司），DW-PF522便攜式彩色多普勒超聲儀（徐州市大為電子設備有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組及造模

動物適應飼養(yǎng)1周后隨機取10只為正常組，余下大鼠行阿霉素造模。造模方法參考文獻[5]。超聲心動圖檢測左心室短軸縮短率（LVFS）<30%[6]，即為心衰造模成功；模型成功后再按隨機數(shù)字表法分為阿霉素模型組（模型組），心康沖劑低、中、高劑量組，芪藶強心膠囊組（對照組），每組各16只。

2.2 藥物制備及干預

心康沖劑溶液配制：白參10 g，黃芪30 g，柴胡5 g，升麻5 g，桔梗5 g，茯苓15 g，薏苡仁30 g，生姜皮10 g，大腹皮10 g，陳皮10 g，桂枝6 g，制附片10 g，砂仁6 g，經湖南省中醫(yī)院藥劑科制成干燥顆粒后，按成人等效劑量即0.5 g/（kg·d）（低）、2倍等效劑量即1 g/（kg·d）（中）、4倍等效劑量即2 g/（kg·d）（高）配制成心康沖劑濃度分別為0.6 g/mL、1.2 g/mL、2.4 g/mL的溶液，對照組給予成人等效劑量芪藶強心膠囊溶液0.06 g/（kg·d），溶液配制成濃度為0.073 g/mL，大鼠給藥劑量按人和動物體表面積折算[7]。正常組、模型組予1 mL/（kg·d）生理鹽水灌服。各組均每日1次，連續(xù)干預8周。8周后進行取材。

2.3 指標及檢測方法

2.3.1 左心室質量指數(shù)（LVMI）觀察心室重構 干預結束后，剪開大鼠胸腔，取出心臟，剪去左、右心房及右室，用預冷PBS沖洗后濾紙拭干水分及血液，稱取左心室質量（LVM），左心室質量指數(shù)（LVMI）=左心室質量LVM（mg）/質量BW（g）×100%。

2.3.2 HE染色觀察纖維化 左心室稱質量后剪取心尖部投入液氮罐中儲存，余下投入10%多聚甲醛溶液固定1周后，石蠟包埋、切片、脫蠟、水化，先蘇木精染液染色7 min，用自來水里沖洗2 min，75%的鹽酸酒精分化15 s，再用自來水沖洗1 min，氨水處理30 s，自來水沖洗1 min，酸化伊紅乙醇液染色12 min，最后自來水快速沖洗，梯度脫水，透明，封片。

2.3.3 Masson染色及膠原容積分數(shù)評估纖維化 石蠟切片脫蠟、水洗。用Weigert蘇木精液染核5～10 min，鹽酸酒精分化，蒸餾水漂洗，用酸性麗春紅染5～10 min。2%冰醋酸水溶液浸泡數(shù)秒，l%磷鉬酸水溶液分化3～5 min，亮綠液染5 min，依次用梯度脫水，二甲苯透明，封片。應用IBAS II圖像軟件分析系統(tǒng)分析大鼠心肌組織的膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF）。CVF=心肌膠原面積/所測視野總面積，最后取平均值。

2.3.4 Real-time PCR法檢測miRNA-21、PTEN mRNA表達 剪取心尖部投入液氮罐中儲存1 h后轉移到-80 ℃低溫冰箱貯存?zhèn)溆谩Ｈ〈笫笞笮氖倚募獠糠? g，Trizol法提取大鼠心臟組織總RNA，行RNA瓊脂糖凝膠電泳。取2 μg以組織總mRNA為模板，逆轉錄cDNA，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 min，冰上冷卻。以各檢測基因引物進行實時定量PCR。定量PCR擴增條件，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。收集每循環(huán)第3個步驟熒光信號量，以2-ΔΔCt反映各樣品相對于對照組樣品目的基因的表達水平，-ΔΔCt=對照組ΔCt-各樣品ΔCt，△Ct=目的△Ct-內參△Ct。每個樣本重復3次后統(tǒng)計分析。

在網址http：//www.mirbase.org/cgi-bin/query.pl？terms=214中搜索miRNA21序列，在NCBI上搜索PTEN基因的序列，primer5軟件設計引物，由上海生工合成。引物資料見表1。

2.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理。全部計量資料用“x±s”表示，先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，滿足正態(tài)性時，采用單因素方差分析，組間比較若方差齊時采用方差分析-LSD檢驗，方差不齊時用方差分析Games-Howell檢驗；不滿足正態(tài)性時選擇秩和檢驗；變量間的相關性用Pearson相關分析及Logistic多元線性回歸分析；以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組左心室質量指數(shù)（LVMI）差異比較

實驗結束，除正常組無死亡外，模型組死亡5只，對照組死亡5只，低劑量組死亡3只，中劑量組死亡3只，高劑量組死亡5只。與正常組比，模型組大鼠LVMI明顯增大（P<0.01）；與模型組比，心康低、中、高劑量三組LVMI比值顯著下降（P<0.01）；與對照組比較，心康低、中、高劑量組無明顯差異；組間比較，心康低、中劑量組之間無差異，但心康高劑量組較中劑量組明顯增大（P<0.05）。見表2。

3.2 HE染色觀察心肌纖維

400×光鏡下觀察，正常組心肌纖維細胞呈紅色，細胞核呈藍色梭形。與正常組相比，模型組心肌細胞肌纖維被大量藍白色膠原纖維組織取代；與模型組相比，心康低、中、高劑組較模型組心肌細胞水腫及炎癥反應相對較輕，藍白色膠原纖維組織相對較少。見圖1。

3.3 Masson染色及心肌膠原纖維容積比（CVF）

400×光鏡下，正常組肌纖維呈紅色，細胞核呈灰藍色。與正常組比，模型組可見大量藍、綠色膠原纖維呈網狀排列，中間可見極少量紅色肌纖維，CVF明顯增大（P<0.01）；與模型組相比，心康沖劑低、中、高劑量組及對照組藍、綠色膠原纖維組織相對較少，CVF顯著下降（P<0.01，P<0.05）；與對照組比較，心康低、中、高劑量無明顯差異；組間比較，心康沖劑低、中、高劑量組之間無明顯差異。見表2、圖2。

3.4 各組miRNA-21、PTENmRNA表達差異比較

與正常組相比，模型組大鼠心肌miRNA-21表達升高（P<0.01），PTENmRNA表達下降（P<0.01）；與模型組比，心康低、中、高劑量組miRNA-21表達下降（P<0.01）、PTENmRNA表達升高（P<0.01）；與對照組比，心康低、中劑量組miRNA-21表達相當，高劑量組明顯升高（P<0.01），而心康沖劑低、中、高劑量組PTENmRNA與之相當；與心康沖劑低、中劑量組比，心康高劑量組miRNA-21明顯增高（P<0.01），PTENmRNA明顯下降，心康沖劑低、中劑量組之間無明顯差異。見表3。

3.5 LVMI與miRNA-21、PTEN表達、CVF Pearson相關分析及Logistic多元線性回歸分析

miRNA-21、PTENmRNA、CVF均與LVMI有明顯線性相關關系（P=0.000），LVMI能被miRNA-21、PTEN表達量、CVF解釋的因素分別占有45.6%、34.6%、22%，其中與PTEN的相關系數(shù)最大（r=0.675）。見表4。

4 討論

慢性心衰疾病可依據(jù)肢體水腫、胸腹水、氣促等臨床癥狀將其歸屬于古醫(yī)籍中“水腫”“喘證”“心悸”范疇。本病證后期病機主要是本虛標實、虛實夾雜。研究證明，中藥對慢性心衰心肌病理損害有很好的預防和治療作用[8-10]，心康沖劑以真武湯、升陷湯、及參苓白術散為基礎方，具有健脾滲濕、溫陽化氣逐水飲之功，可用于治療慢性心衰水腫、喘證、心悸等水濕內停之證[11]。中醫(yī)藥治療慢性心衰療效肯定，芪藶強心膠囊是目前臨床公認治療頑固性心衰的有效藥物，其有效性和安全性通過了美國“多中心臨床試驗，被2014年《JACC》主編A NDeMaria教授評為2013年度亮點[12]，并實驗證明芪藶強心膠囊具有抗心肌重構、心肌纖維化的作用[13]。

慢性心衰主要的病理現(xiàn)象是心臟重構，主要包括心肌細胞肥大、壞死凋亡、纖維化。LVMIJ是反映左心室重構的一個指標。心肌成纖維細胞異常增生是心肌纖維化的重要原因。miRNA-21在心臟成纖維細胞[14]、內皮細胞和血管平滑肌細胞[15]等主要的心血管細胞類型都有表達，PTEN是miRNA-21介導心肌纖維化的靶基因之一[16]。研究顯示下調miRNA-21表達能顯著抑制主動脈結扎小鼠心衰模型心肌細胞肥厚[17]，miRNA-21及其靶基因PTEN在小鼠缺血再灌注損傷所導致的心臟重構心肌纖維化的模型中發(fā)揮主導作用[18]，CVF是反映心肌纖維化的重要指標之一。

本實驗中，HE染色、Masson及CVF均顯示模型組大鼠心肌纖維化明顯，纖維化心肌中miRNA-21表達升高、PTEN表達下降；而心康沖劑能顯著抑制心肌纖維化，作用途徑可能是通過下調miRNA-21、升高PTENmRNA表達減輕心肌纖維化。并且通過相關回歸分析發(fā)現(xiàn)PTEN在本實驗的觀察因素中相對其他影響因素在心肌纖維化、心肌重構中可能起相對重要的作用。因此，在慢性心衰病理過程中如何調控PTEN基因表達對改善慢性心衰的預后有很重要的意義。另外，值得探討的是，CVF在心康沖劑低、中、高劑量組之間無明顯差異，而LVMI心康高劑量組較中劑量組明顯增大，心康沖劑低、中、高劑量組三組CVF與LVMI不完全一致說明心康沖劑低、中、高劑量組在影響左心室重構方面除CVF以外可能有另外的因素參與，如心肌凋亡等；心康沖劑低、中、高劑量組在miRNA-21、PTENmRNA表達上并沒有呈正性量效關系，說明心康低、中、高劑量在抗心肌纖維化作用中有一定差異性，高劑量組相對于低、中劑量組存在負性量效關系。因此，今后有必要增大樣本數(shù)進一步研究心康沖劑不同劑量與療效及毒性的關系，從而為臨床療效提高提供最佳劑量參考。

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