符運(yùn)會(huì)　屈建航　張璐潔　馬文文　 盧斌斌　李海峰

摘要：【目的】研究瓊脂和結(jié)冷膠兩種培養(yǎng)基凝固劑對(duì)水體沉積物中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的影響，為挖掘環(huán)境微生物資源提供科學(xué)依據(jù)。【方法】以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以瓊脂和結(jié)冷膠為凝固劑，利用純培養(yǎng)法對(duì)江蘇省太湖水體沉積物中的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，結(jié)合16S rRNA序列分析法對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析?！窘Y(jié)果】以瓊脂和結(jié)冷膠為凝固劑，分離獲得的細(xì)菌總量分別為2.4×105和2.1×105 CFU/g沉積物；16S rRNA序列分析剔除重復(fù)菌株后，對(duì)應(yīng)得到20和21株細(xì)菌，分別隸屬于11和17個(gè)細(xì)菌屬，均歸屬于厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）三大類群。兩種不同凝固劑培養(yǎng)基分離獲得的細(xì)菌屬組成差異明顯，在LB瓊脂培養(yǎng)基分離獲得的20株細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus，9株）、動(dòng)性桿菌屬（Planomicrobium，2株）、房間芽孢桿菌屬（Domibacillus，1株）、類芽孢八疊球菌屬（Paenisporosarcina，1株）、土壤芽孢桿菌屬（Solibacillus，1株）、紅球菌屬（Rhodococcus，1株）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium，1株）、微桿菌屬（Microbacterium，1株）、無色桿菌屬（Leucobacter，1株）、檸檬球菌屬（Citricoccus，1株）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，1株）；在LB結(jié)冷膠培養(yǎng)基上分離獲得的21株細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬（4株）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus，2株）、微小桿菌屬（Exiguobacterium，1株）、鳥氨酸芽孢桿菌屬（Ornithinibacillus，1株）、葡萄球菌屬（Staphylococcus，1株）、虛構(gòu)芽孢桿菌屬（Fictibacillus，1株）、紅球菌屬（1株）、迪茨氏菌屬（Dietzia，1株）、微桿菌屬（1株）、考克氏菌屬（Kocuria，1株）、四球菌屬（Tessaracoccus，1株）、短桿菌屬（Brevibacterium，1株）、兩面神菌屬（Janibacter，1株）、腸桿菌屬（Enterobacter，1株）、依格納季氏菌屬（Ignatzschineria，1株）、副球菌屬（Paracoccus，1株）和普羅維登斯菌屬（Providencia，1株）?！窘Y(jié)論】結(jié)冷膠作為凝固劑在一定程度上提高了可培養(yǎng)細(xì)菌的種類數(shù)，結(jié)冷膠和瓊脂兩種凝固劑聯(lián)合使用可獲得更多的細(xì)菌種類。

關(guān)鍵詞： 凝固劑；結(jié)冷膠；瓊脂；培養(yǎng)基；可培養(yǎng)細(xì)菌；沉積物

中圖分類號(hào)： S154.381； Q93 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）09-1787-07

0 引言

【研究意義】湖泊是重要的環(huán)境生態(tài)資源，其水域表層沉積物是物質(zhì)轉(zhuǎn)化和循環(huán)的重要場(chǎng)所，而微生物代謝活動(dòng)是物質(zhì)轉(zhuǎn)化和循環(huán)的重要推動(dòng)力（Sauvain et al.， 2014）。水體沉積物中蘊(yùn)含豐富的細(xì)菌群落，其多樣性與生態(tài)環(huán)境息息相關(guān)，互為影響（唐婧等，2015）。因此，開展水體沉積物中細(xì)菌群落多樣性研究，對(duì)了解湖泊生態(tài)及微生物資源開發(fā)具有重要意義。傳統(tǒng)的微生物多樣性研究離不開微生物的分離和培養(yǎng)，但有研究表明，傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)獲得的微生物數(shù)量只占環(huán)境微生物總量的0.1%～1.0%（Amann et al.， 1995），如何提高微生物可培養(yǎng)性，分離獲得更多菌種資源，仍是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有報(bào)道可通過不依賴于培養(yǎng)的分子生態(tài)學(xué)方法研究湖泊沉積物微生物多樣性。如王福芳（2013）利用PCR-DGGE技術(shù)和構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫(kù)的方法，分析了太湖沉積物中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，共鑒定出48個(gè)不同的基因型；楊江科和程占冰（2016）采用16S rRNA基因克隆文庫(kù)及PCR-RFLP分析方法對(duì)武漢東湖沉積物中的細(xì)菌群落進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌群體包含13個(gè)門和2個(gè)未知類群；薛銀剛等（2018）通過高通量測(cè)序方法對(duì)太湖冬季表層沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)9個(gè)樣品中的細(xì)菌主要隸屬于25門51綱96屬。在微生物分離、培養(yǎng)方面，近年來有報(bào)道可通過降低營(yíng)養(yǎng)濃度（Hashimoto et al.， 2009）、多種培養(yǎng)方法組合（Sipkema et al.， 2011）和改變培養(yǎng)基配方（張瑞杰等，2016）等手段提高微生物的可培養(yǎng)性。傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)多采用瓊脂作為凝固劑。已有研究表明，結(jié)冷膠作為凝固劑時(shí)分離得到微生物的數(shù)量和種類與以瓊脂為凝固劑差別較明顯（Davis et al.， 2005；Tamaki et al.， 2009），在結(jié)冷膠培養(yǎng)基上能分離得到更多的微生物種類（Suzuki et al.， 1999）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，在水體沉積物的微生物分離培養(yǎng)中以結(jié)冷膠作為培養(yǎng)基凝固劑的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以江蘇省太湖表層沉積物為材料，利用純培養(yǎng)方法結(jié)合16S rRNA序列分析，比較不同培養(yǎng)基凝固劑對(duì)水體沉積物中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的影響，為挖掘環(huán)境微生物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供式樣品：利用抓土漏斗法采集太湖表層沉積物樣品，4 ℃運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。主要試劑：Csp6（Thermo）、Hinf I及PCR試劑（Takara）、結(jié)冷膠（索萊寶生物科技有限公司）、瓊脂（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。主要儀器設(shè)備：C1000 Touch PCR儀和Bio-Rad Gel Doc XR凝膠成像儀（Bio-Rad）。

培養(yǎng)基：LB瓊脂培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂15 g/L、pH 7.0～7.2，1×105 Pa滅菌20 min）、LB結(jié)冷膠培養(yǎng)基[LB瓊脂培養(yǎng)基中以結(jié)冷膠替換瓊脂，添加量8 g/L（Janssen et al.， 2002）]。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 細(xì)菌分離純化 稱取10 g沉積物樣品置于含有玻璃珠的90 mL無菌水中，28 ℃振蕩1 h后，靜置30 min，取上清液，10倍梯度稀釋至10-9，分別涂布于LB瓊脂和結(jié)冷膠培養(yǎng)基上，每梯度3組平行。28 ℃培養(yǎng)3 d后，觀察并記錄單菌落數(shù)，細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)方法參考陳澤斌等（2014）的方法，挑取形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行分離純化，保存于斜面培養(yǎng)基和甘油管中。

1. 2. 2 16S rRNA序列PCR擴(kuò)增 堿裂解法（薩姆布魯克和拉塞爾，2002）制備細(xì)菌DNA模板，采用16S rRNA通用引物27f和1492r（Moreno et al.， 2002）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和條件參照薩姆布魯克和拉塞爾（2002）的方法進(jìn)行，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1. 2. 3 16S rRNA序列分析 將不同菌株的16S rRNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（約1500 bp）送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析后，利用MEGA 7.0以鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)育樹用Bootstrap法（1000次重復(fù)）檢驗(yàn)可信度。

2 結(jié)果與分析

2. 1 細(xì)菌計(jì)數(shù)及分離結(jié)果

分離結(jié)果表明，LB瓊脂培養(yǎng)基和LB結(jié)冷膠培養(yǎng)基上的菌量分別為2.4×105和2.1×105 CFU/g沉積物，前者分離到的可培養(yǎng)菌量約為后者的1.1倍。結(jié)合16S rRNA序列分析剔除重復(fù)菌株后，兩種培養(yǎng)基分別獲得20和21株不同屬的細(xì)菌。將16S rRNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，LB瓊脂培養(yǎng)基中細(xì)菌的登錄號(hào)為MG025780～MG025801（圖1），LB結(jié)冷膠培養(yǎng)基中細(xì)菌的登錄號(hào)為MG04976～MG049786（圖2）。

2. 2 LB瓊脂培養(yǎng)基分離細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

LB瓊脂培養(yǎng)基分離獲得20株細(xì)菌的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖1）表明，20株細(xì)菌歸屬于厚壁菌門（14株）、放線菌門（5株）和變形菌門（1株）三大類群，分別占分離菌株總數(shù)的70.0%、25.0%和5.0%。14株厚壁菌門細(xì)菌中，有9株與芽孢桿菌屬（Bacillus）關(guān)系密切，為厚壁菌門中的最優(yōu)勢(shì)屬，其次為動(dòng)性桿菌屬（Planomicrobium，2株）、房間芽孢桿菌屬（Domibacillus，1株）、類芽孢八疊球菌屬（Paenisporosarcina，1株）和土壤芽孢桿菌屬（Solibacillus，1株）；放線菌門細(xì)菌主要與紅球菌屬（Rhodococcus，1株）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium，1株）、微桿菌屬（Microbacterium，1株）、無色桿菌屬（Leucobacter，1株）和檸檬球菌屬（Citricoccus，1株）密切相關(guān)；變形菌門分離到1株與不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）關(guān)系密切的細(xì)菌。

2. 3 LB結(jié)冷膠培養(yǎng)基分離細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

LB結(jié)冷膠培養(yǎng)基分離獲得21株細(xì)菌的16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果（圖2）表明，21株細(xì)菌歸屬于厚壁菌門（10株）、放線菌門（7株）和變形菌門（4株），分別占分離菌株總數(shù)的47.6%、33.3%和19.1%。10株厚壁菌門細(xì)菌中，有4株與芽孢桿菌屬關(guān)系密切，為厚壁菌門中的優(yōu)勢(shì)屬，其次還檢測(cè)到賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus，2株）、微小桿菌屬（Exiguobacterium，1株）、鳥氨酸芽孢桿菌屬（Ornithinibacillus，1株）、葡萄球菌屬（Staphylococcus，1株）和虛構(gòu)芽孢桿菌屬（Fictibacillus，1株）；放線菌門細(xì)菌主要為紅球菌屬（1株）、迪茨氏菌屬（Dietzia，1株）、微桿菌屬（1株）、考克氏菌屬（Kocuria，1株）、四球菌屬（Tessaracoccus，1株）、短桿菌屬（Brevibacterium，1株）和兩面神菌屬（Janibacter，1株）；歸于變形菌門的菌株與腸桿菌屬（Enterobacter，1株）、依格納季氏菌屬（Ignatzschineria，1株）、副球菌屬（Paracoccus，1株）和普羅維登斯菌屬（Providencia，1株）關(guān)系密切。

2. 4 兩種凝固劑分離結(jié)果比較

LB瓊脂培養(yǎng)基和LB結(jié)冷膠培養(yǎng)基分離得到的20和21株細(xì)菌在門分類水平上均歸屬于厚壁菌門、放線菌門和變形菌門三大類群。在屬分類水平上（圖3），芽孢桿菌屬在兩種培養(yǎng)基中均為優(yōu)勢(shì)屬，紅球菌屬和微桿菌屬在兩種培養(yǎng)基中也均有分離；但動(dòng)性桿菌屬、房間芽孢桿菌屬、類芽孢八疊球菌屬、土壤芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、無色桿菌、檸檬球菌屬和不動(dòng)桿菌屬8個(gè)屬僅從LB瓊脂培養(yǎng)基中分離得到（圖3-A）；而微小桿菌屬、鳥氨酸芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬、虛構(gòu)芽孢桿菌屬、考克氏菌屬、四球菌屬、迪茨氏菌屬、兩面神菌屬、短桿菌屬、腸桿菌屬、依格納季氏菌屬、副球菌屬和普羅維登斯菌屬14個(gè)屬僅從LB結(jié)冷膠培養(yǎng)基中分離得到（圖3-B），在LB結(jié)冷膠培養(yǎng)基上分離到的菌屬數(shù)量約為瓊脂培養(yǎng)基的1.5倍?？梢姡脙煞N凝固劑培養(yǎng)基分離得到的細(xì)菌種類差異明顯。

3 討論

由于微生物生存環(huán)境的復(fù)雜性，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法并不能滿足微生物生長(zhǎng)的需要，已有報(bào)道通過延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間（Janssen et al.， 2002）、稀釋培養(yǎng)（Cho and Giovannoni， 2004）、添加原始營(yíng)養(yǎng)因子（李曉丹等，2017）等方法可提高可培養(yǎng)微生物種群數(shù)量和種類；模擬自然環(huán)境（Bollmann et al.， 2010）和高通量培養(yǎng)（Ringeisen et al.， 2015）等技術(shù)也能成功獲得部分不可培養(yǎng)或極難培養(yǎng)的微生物。凝固劑作為培養(yǎng)基的重要影響因素，在微生物資源開發(fā)方面值得重視。瓊脂作為微生物培養(yǎng)基凝固劑一直被使用，但近年來有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)冷膠代替瓊脂可提高微生物的可培養(yǎng)數(shù)量和種類，增加開發(fā)新菌種的幾率。Tamaki等（2009）在研究富營(yíng)養(yǎng)湖泊沉積物細(xì)菌多樣性時(shí)利用瓊脂和結(jié)冷膠兩種凝固劑進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，結(jié)冷膠作為凝固劑不僅提高了微生物的可培養(yǎng)數(shù)量、增大了新菌發(fā)現(xiàn)的可能性，還縮小了與分子生態(tài)學(xué)方法獲得結(jié)果的差異。蔡瑩等（2010）發(fā)現(xiàn)結(jié)冷膠培養(yǎng)基上分離的細(xì)菌數(shù)量和多樣性高于瓊脂培養(yǎng)基。金一荻等（2012）在研究烏梁素海水中可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性時(shí)采用結(jié)冷膠作為培養(yǎng)基凝固劑，發(fā)現(xiàn)可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)多于傳統(tǒng)瓊脂培養(yǎng)基。Rygaard等（2017）研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基凝固劑由瓊脂更換為結(jié)冷膠時(shí)，海洋微生物活細(xì)胞數(shù)量提高了3～40倍，可培養(yǎng)菌量最高達(dá)6.6%。本研究比較瓊脂和結(jié)冷膠兩種凝固劑培養(yǎng)基對(duì)太湖水體沉積物中細(xì)菌可培養(yǎng)性的影響，所得細(xì)菌量分別為2.4×105和2.1×105 CFU/g沉積物，前者分離到的可培養(yǎng)細(xì)菌量約是后者的1.1倍。二者在分離細(xì)菌具體菌屬組成上存在較明顯差異，僅芽孢桿菌屬、紅球菌屬和微桿菌屬細(xì)菌在兩種凝固劑培養(yǎng)基中共有。在LB瓊脂培養(yǎng)基中分離得到房間芽孢桿菌屬、動(dòng)性桿菌屬和土壤芽孢桿菌屬等8個(gè)屬；而迪茨氏菌屬、依格納季氏菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬和鳥氨酸芽孢桿菌屬等14個(gè)屬在LB結(jié)冷膠培養(yǎng)基上特有，在LB結(jié)冷膠培養(yǎng)基上分離到的菌屬數(shù)量約為瓊脂培養(yǎng)基的1.5倍。

Zhang等（2018）利用中等濃度（0.9%）的結(jié)冷膠作為培養(yǎng)基凝固劑培養(yǎng)酵母菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)和計(jì)數(shù)方面與瓊脂培養(yǎng)基差別不明顯。在本研究中，兩種凝固劑在檢測(cè)水體沉積物可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的種類和數(shù)量上均有差別，推測(cè)造成這種差別的原因與二者間的組分差異有關(guān)。Rygaard等（2017）研究認(rèn)為瓊脂作為凝固劑可能使培養(yǎng)群落的組成偏向于專門利用瓊脂或其釋放的半乳糖殘基的微生物；而結(jié)冷膠是由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸及L-鼠李糖通過糖苷鍵連接而成的一種主要源自微生物的胞外多糖，可能來自結(jié)冷膠的葡萄糖、葡萄糖醛酸和鼠李糖殘基，能刺激更廣泛的微生物生長(zhǎng)?？梢姡虅┳鳛槲⑸锓蛛x培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的重要組成，使用瓊脂外的其他膠凝劑，可為了解環(huán)境中可培養(yǎng)微生物的多樣性及資源開發(fā)提供一定幫助。

4 結(jié)論

采用瓊脂和結(jié)冷膠兩種培養(yǎng)基凝固劑，比較不同培養(yǎng)基凝固劑對(duì)水體沉積物中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性的影響，結(jié)果表明，兩種培養(yǎng)基分別分離得到20和21種細(xì)菌，各屬于11和17個(gè)種屬，菌屬組成差異明顯，其中僅有芽孢桿菌屬、紅球菌屬和微桿菌屬在兩種培養(yǎng)基中均可分離獲得。可見，結(jié)冷膠凝固劑一定程度上提高了可培養(yǎng)細(xì)菌的種類數(shù)，若同時(shí)利用結(jié)冷膠和瓊脂兩種凝固劑可獲得更多的細(xì)菌種類。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）