朱琳　孫冰　孫杰　郭容利

摘要：【目的】明確豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）JS2008株的序列特征及其連續(xù)傳代后的序列變化規(guī)律，為篩選出新的疫苗候選毒株提供參考依據(jù)?！痉椒ā繉⒎蛛x自華東地區(qū)某發(fā)病豬場的PEDV JS2008株在Vero細(xì)胞系上傳代培養(yǎng)至100代，選取部分代次進(jìn)行病毒滴度測定；每隔10代提取病毒RNA，采用RT-PCR對各代次病毒的S基因、ORF3基因和N基因進(jìn)行擴(kuò)增，并與PEDV經(jīng)典和流行參考毒株進(jìn)行序列比對及遺傳變異分析。【結(jié)果】PEDV JS2008株經(jīng)連續(xù)傳代至100代，其病毒滴度由105.5 TCID50/0.1 mL上升至107.5 TCID50/0.1 mL。JS2008株在傳代過程中共有11處堿基發(fā)生突變，其中9處發(fā)生在傳代培養(yǎng)的第10～20代，變異主要位于S基因上（7/11）；同時發(fā)現(xiàn)JS2008株及其傳代株與attenuated DR13株的相似性最高?；赟基因和N基因序列構(gòu)建的PEDV系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹均表明JS2008株各代次與attenuated DR13株同處于Group 3進(jìn)化群；基于ORF3基因序列構(gòu)建的PEDV系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹則顯示，JS2008株各代次與attenuated DR13株均處于同一進(jìn)化群（Group 2）?！窘Y(jié)論】PEDV JS2008株通過Vero細(xì)胞系進(jìn)行體外連續(xù)傳代至100代，其堿基突變主要發(fā)生在病毒傳代培養(yǎng)的第10～20代，病毒滴度明顯提高，抗原量增加，為研制新型PEDV疫苗提供可能，同時推測病毒傳代培養(yǎng)10～20代是病毒發(fā)生變異以適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的活躍期。

關(guān)鍵詞： 豬流行性腹瀉病毒（PEDV）；JS2008株；傳代培養(yǎng)；遺傳變異

中圖分類號： S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）09-1833-08

0 引言

【研究意義】豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）為單股正鏈RNA病毒，隸屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）（Huang et al.，2013）。PEDV能引起仔豬腹瀉、脫水，致死率高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失；成年豬感染后主要導(dǎo)致厭食、嗜睡和腹瀉，但死亡率低（de Vries et al.，1997）。自1978年在比利時首次報道PEDV CV777株以來（Pensaert and de Bouck，1978），已在歐洲、亞洲及美洲的多個國家和地區(qū)暴發(fā)，且至今仍在廣泛流行。目前，我國商品化的PEDV疫苗主要有傳統(tǒng)的滅活苗和弱毒苗，但免疫效果并不理想，尤其是近年來PEDV再次暴發(fā)流行，表明傳統(tǒng)疫苗已不能有效預(yù)防該病的發(fā)生（Lin et al.，2017）。因此，重新尋找更加有效安全的疫苗候選毒株對防控PEDV暴發(fā)流行具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】PEDV的基因70%是聚合酶基因，編碼復(fù)制酶聚合蛋白（Li et al.，2013），其編碼的結(jié)構(gòu)蛋白包括纖突糖蛋白（Spike glycoprotein，由S基因編碼）、膜蛋白（Membrane protein，由M基因編碼）、核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，由N基因編碼）、囊膜蛋白（Envelope protein，由E基因編碼）及附屬的ORF3基因（Li et al.，2013；高君愷等，2014；祁寒松等，2017；祁光宇等，2018）。在PEDV的自然流行感染過程中，S基因極易發(fā)生突變，尤其在病毒與細(xì)胞間的膜融合及病毒侵入過程中扮演重要角色，其中S蛋白的S1結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合細(xì)胞受體，而S2結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)細(xì)胞膜融合活性，即S基因變異與冠狀病毒的宿主適應(yīng)性和種間傳播關(guān)系密切（Belouzard et al.，2012；Lin et al.，2017）；在PEDV體外連續(xù)傳代對細(xì)胞系的適應(yīng)過程中，S基因的變異起決定性作用（劉雙喜，2017）。Park等（2008）研究表明，以細(xì)胞傳代培養(yǎng)冠狀病毒時，高代次病毒會出現(xiàn)ORF3基因突變，且通過細(xì)胞系適應(yīng)傳代PEDV，即ORF3基因的變異可能會使其毒力下降。姜艷平等（2015）研究證實，N基因是PEDV相對保守的基因，N蛋白是PEDV感染檢測的最佳蛋白，但該基因的變異可能會導(dǎo)致其無法被目前的常規(guī)檢測手段檢出。此外，Lin等（2017）研究表明PEDV致弱是基因組多個突變組合的結(jié)果，且可通過多種分子機(jī)制發(fā)生?！颈狙芯壳腥朦c】明確PEDV的基因序列特征及連續(xù)傳代后的序列變化規(guī)律，可為篩選候選疫苗株奠定基礎(chǔ)，但目前關(guān)于PEDV體外培養(yǎng)傳代的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】將分離自華東地區(qū)某豬場（免疫后仍發(fā)?。┑腜EDV JS2008株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代至100代，對各代次病毒的S基因、ORF3基因和N基因進(jìn)行擴(kuò)增測序與遺傳變異分析，明確該毒株的序列特征及其連續(xù)傳代后的序列變化規(guī)律，為篩選出新的疫苗候選毒株提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

PEDV JS2008株（KC210146.1）由本課題組分離自華東地區(qū)某豬場發(fā)生急性腸炎與水樣腹瀉的仔豬排泄物（Li et al.，2013）；Vero細(xì)胞系由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所人獸共患實驗室保存提供，使用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1. 2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中PEDV CV777株和JS2008株的核酸序列，設(shè)計特異引物擴(kuò)增JS2008株各代次的S1基因部分片段、S2基因部分片段、N基因全序列及ORF3基因全序列，引物序列詳見表1。

1. 3 PEDV JS2008株傳代及其病毒滴度測定

PEDV JS2008株以106.5 TCID50/0.1 mL接種于形成良好單層的Vero細(xì)胞上，加入2%胰酶，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時回收病毒，反復(fù)凍融3次后繼續(xù)傳代，傳代病毒均置于-80 ℃保存。選取PEDV JS2008株第20、40、60、80和100代及其親本株進(jìn)行病毒滴度測定。

1. 4 病毒RNA提取

在PEDV JS2008株傳代培養(yǎng)過程中，收集各代次細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物，包括Vero細(xì)胞和培養(yǎng)基上清， -80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ?、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100代次細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物，反復(fù)凍融3次，采用Column Vrial RNAout Kit（北京天恩澤基因科技有限公司）提取總RNA，溶于20.0 μL DEPC水中， -20 ℃保存待檢。

1. 5 RT-PCR擴(kuò)增及測序

基于表1中的特異引物，使用EasyScript One-Step RT-PCR SurperMix Kit（北京全氏金生物科技有限公司）RT-PCR擴(kuò)增1、10、20[…]90、100代次JS2008株的S1基因、S2基因、N基因和ORF3基因。反應(yīng)體系20.0 μL，包括：10.0 μL 2×One-Step Reaction Mix，0.4 μL One-Step Enzyme Mix，0.4 μL上游引物（10 μmol/L），0.4 μL下游引物（10 μmol/L），3.0 μL RNA模板，以無RNA酶水補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：45 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94 ℃預(yù)變性5 min及如下35個反應(yīng)循環(huán)[（1）S1基因：94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；（2）S2基因：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；（3）N基因：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 min；（4）ORF3基因：94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s]；最后72 ℃延伸10 min。RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶，以AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美國AxyGen公司）進(jìn)行回收純化。將目的cDNA連接pMD19-T載體后，送至南京思普金生物科技有限公司測序。

1. 6 序列分析

使用DNAMAN、DNASTAR和MEGA等在線軟件比對分析PEDV JS2008株各代次與典型毒株的核酸序列，包括經(jīng)典毒株CV777（AF353511.1）及近期流行于我國、美國、韓國的毒株[AJ1102（JX188454.1）、LC（JX489155.1）、GD-1（JX647847.1）、AH2012（KC

210145.1）、JS-HZ2012（KC210147.1）、BJ-2011-1（JN

825712.1）、CH/S（JN547228.1）、IA1（KF468753.1）、IA2（KF468754.1）、USA-Colorado-2013（KF272920.1）、USA-lowa-18984-2013、virulent DR13（JQ023161.1）和attenuated DR13（JQ023162.1）]。

2 結(jié)果與分析

2. 1 JS2008株不同代次病毒滴度測定結(jié)果

選取PEDV JS2008株第20、40、60、80、100代傳代毒株及其親本毒株進(jìn)行滴度測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在傳代過程中，JS2008株的病毒滴度由105.5 TCID50/0.1 mL上升至107.5 TCID50/0.1 mL（圖1）。

2. 2 基因序列相似性分析結(jié)果

2. 2. 1 S1基因的相似性 采用DNASTAR（Clus-talW分析）和MEGA 5.0對JS2008株各代次的基因序列與其他PEDV參考株的序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JS2008株原代S1基因序列片段與attenuated DR13株的相似性最高（99.4%），但傳代至第20代發(fā)生變異后，其相似性降至98.9%（圖2）。

2. 2. 2 ORF3基因的相似性 采用DNASTAR（Clus-talW分析）和MEGA 5.0對JS2008株各代次的基因序列與其他PEDV參考株的序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JS2008株原代ORF3基因序列與attenuated DR13株的相似性最高，為99.1%，尤其是傳代至第100代后其相似性升高至99.3%（圖3）。

2. 2. 3 N基因的相似性 采用DNASTAR（Clus-talW分析）和MEGA 5.0對JS2008株各代次的基因序列與其他PEDV參考株的序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)JS2008株原代N基因與attenuated DR13株的相似性最高，為99.8%，傳代至第20代發(fā)生變異后與attenuated DR13株的相似性達(dá)99.9%（圖4）。

2. 3 各代次JS2008株基因序列比對分析結(jié)果

2. 3. 1 S基因序列比對分析 以DNAMAN中的Alignment進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在JS2008株傳代過程中S基因序列的第26、68、83、99、896、938和962位點發(fā)生突變，突變位置如圖5中箭頭所指，且7處堿基突變均發(fā)生在第10～20代傳代期間，而隨后的傳代中未出現(xiàn)變異。在這些發(fā)生突變的位點中，JS2008株原代位點與attenuated-DR13株相同，而突變后的位點與多數(shù)近期流行的變異毒株相同，如AH2012、JS-HZ2012、AJ1102和IA1等毒株。

2. 3. 2 ORF3基因序列比對分析 在選取的ORF3基因序列中，JS2008株傳代過程共出現(xiàn)3處堿基變異，分別在第519、713和787位點（圖6）。其中，第519位點的突變出現(xiàn)在第10～20代傳代過程中，而第713和787位點的突變出現(xiàn)在較高代次中。JS2008株的第519和713位點，與其他所有PEDV參考株的堿基均不同，但經(jīng)傳代培養(yǎng)發(fā)生變異后，與其他PEDV參考株變得一致；第787位點的突變較特殊，發(fā)生在第70～80代傳代過程中，且該堿基不同于其他PEDV參考株。

2. 3. 3 N基因序列比對分析 JS2008株在Vero細(xì)胞系上的傳代過程中，N基因的第327位點發(fā)生突變，且該突變與S基因發(fā)生的突變相似，也出現(xiàn)在第10～20代的傳代過程中，隨后傳代至100代時該突變?nèi)匀环€(wěn)定保留（圖7），N基因在傳代過程中出現(xiàn)的突變并未引起氨基酸變化。

2. 4 各代次JS2008株遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

2. 4. 1 S基因序列遺傳進(jìn)化分析 綜合已知代表毒株序列，應(yīng)用MEGA 5.0構(gòu)建基于S基因序列的PEDV系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，JS2008株原代與其第10代傳代株和attenuated DR13株處于同一分支，第20～100代傳代株則聚為另一分支，但均屬于Group 3進(jìn)化群（圖8）。

2. 4. 2 ORF3基因序列遺傳進(jìn)化分析 綜合已知代表毒株序列，應(yīng)用MEGA 5.0構(gòu)建基于ORF3基因序列的PEDV系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖9），結(jié)果顯示，JS2008株各代次與attenuated DR13株均處于同一進(jìn)化群（Group 2）。

2. 4. 3 N基因序列遺傳進(jìn)化分析 綜合已知代表毒株序列，應(yīng)用MEGA 5.0構(gòu)建基于N基因序列的PEDV系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖10），結(jié)果顯示，JS2008株各代次與attenuated DR13株均處于同一進(jìn)化群（Group 3）。

3 討論

本研究將分離自華東地區(qū)某發(fā)病豬場的PEDV JS2008株進(jìn)行體外連續(xù)傳代至100代，并對各傳代株的病毒滴度及遺傳變異情況進(jìn)行分析測定。在傳代過程中，每隔10代進(jìn)行病毒滴度檢測，發(fā)現(xiàn)病毒滴度由親本株的105.5 TCID50/0.1 mL上升至107.5 TCID50/0.1 mL，病毒滴度明顯提高。Huang等（2013）研究認(rèn)為，JS2008株是疫苗株attenuated DR13的變異株，其原因是二者的基因序列相似度極高。attenuated DR13株是適應(yīng)Vero細(xì)胞系的毒株，而JS2008株也能在Vero細(xì)胞系中穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，進(jìn)一步證實這兩株毒株間的同源關(guān)系。此外，對PEDV JS2008株各代次的多個基因序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其堿基變異主要出現(xiàn)在S基因上（7/11），且這7處堿基突變均發(fā)生在傳代至第10～20代間，隨后的傳代中則未出現(xiàn)變異；而遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，JS2008株原代與其第10代傳代株和Attenuated DR13株處于同一分支，第20～100代傳代株則聚為另一分支，即傳代株呈向強(qiáng)毒株變異的趨勢；同時發(fā)現(xiàn)JS2008株各代次的ORF3基因與弱毒株的相似性呈升高趨勢，說明ORF3基因在PEDV致弱方面發(fā)揮重要作用（Beall et al.，2016）。

與PEDV強(qiáng)毒株AH2012/12（Fan et al.，2017）相比，本研究經(jīng)傳代獲得的JS2008第100代傳代株毒力很弱，并未因相似性降低而導(dǎo)致毒力變強(qiáng)，但在傳代過程中其病毒滴度明顯提高，因此推測S基因的突變位點與PEDV能更好適應(yīng)Vero細(xì)胞系相關(guān)；同時JS2008第100代傳代株與親本株的毒力比較，還需進(jìn)一步通過動物試驗證實。ORF3基因和N基因的序列分析結(jié)果顯示，JS2008株與attenuated DR13株的相似性最高，且各基因序列分析結(jié)果均表明JS2008株與attenuated DR13株處于同一進(jìn)化群（Group 3）。attenuated DR13株在ORF3基因中有一段缺失序列，是其與virulent DR13株的主要區(qū)別；而JS2008株及其傳代株的ORF3基因序列并無缺失，與virulent DR13株或CH/S株的序列相同。故推測JS2008株可能是attenuated DR13株發(fā)生變異，且與CH/S株或其他類似流行毒株發(fā)生基因重組而獲得的毒株（Li et al.，2013）。本研究發(fā)現(xiàn)，在JS2008株的傳代過程中，ORF3基因發(fā)生變異后促使該毒株與attenuated DR13株的相似度提高，即適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)后，JS2008株的ORF3基因序列發(fā)生變異使其更接近attenuated DR13株。attenuated DR13株本身為適應(yīng)細(xì)胞系培養(yǎng)的疫苗毒株，同時JS2008株在傳代過程中其病毒滴度明顯提高，表明ORF3基因的變異可能有助于提高PEDV對培養(yǎng)細(xì)胞系的適應(yīng)性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)JS2008株傳代過程中的堿基突變（9/11）主要發(fā)生在病毒傳代培養(yǎng)的第10～20代，推測病毒傳代培養(yǎng)10～20代是病毒發(fā)生變異以適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的活躍期。

4 結(jié)論

PEDV JS2008株通過Vero細(xì)胞系進(jìn)行體外連續(xù)傳代至100代，其堿基突變主要發(fā)生在病毒傳代培養(yǎng)的第10～20代，病毒滴度由105.5 TCID50/0.1 mL上升至107.5 TCID50/0.1 mL，抗原量增加，為研制新型PEDV疫苗提供可能，同時推測病毒傳代培養(yǎng)10～20代是病毒發(fā)生變異以適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的活躍期。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）