張安寧 羅雪林 黃思琴 唐成林 趙丹丹羅翱 譚程方 代妮 于芒

1重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院（重慶400016）

2重慶市南岸區(qū)龍門浩街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心（重慶 400064）

3斯坦福大學(xué)臨床科學(xué)研究中心（美國加州 94305）

骨骼肌損傷是運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的常見損傷之一，其中急性骨骼肌鈍挫傷較為常見[1]，以股四頭肌和腓腸肌的發(fā)病率最高[2]，骨骼肌正常生理結(jié)構(gòu)的破壞和運動功能障礙是其主要的預(yù)后及演變。骨骼肌損傷后，肌肉組織的修復(fù)和再生能力與諸多因素有關(guān)，如：生長發(fā)育的信號通路、調(diào)控基因、生長因子及細胞因子的活性改變等[3-4]，以往關(guān)于骨骼肌鈍挫傷模型的研究多集中在與骨骼肌損傷修復(fù)相關(guān)的生長因子及細胞因子等的時程變化趨勢上[5-8]，而關(guān)于磷酸肌醇三激酶（phos?phoinositide3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B （protein ki?nase B，Akt/PKB）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammali?an target of rapamycin，mTOR）生長發(fā)育信號通路在骨骼肌損傷修復(fù)中的作用及機制研究的相關(guān)報道較少。本研究觀察PI3K/Akt/mTOR蛋白合成途徑在大鼠急性骨骼肌鈍挫傷修復(fù)中的表達變化，及其對骨骼肌成肌分化抗原（myogenic differentiation antigen，MyoD）和肌細胞生成素（myogenin，MyoG）的調(diào)控作用，探索骨骼肌損傷的修復(fù)機制，以幫助臨床醫(yī)生及科研學(xué)者尋找最佳的治療靶點和時間點，縮短療程，從而減輕患者的痛苦及經(jīng)濟負擔。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和分組

SPF（specific pathogen free）級健康成年雄性 SD（Sprague Dawley）大鼠36只，8～9周齡，體質(zhì)量220～250 g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2012-0001，實驗過程中對動物的處置方法按照國家科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中的倫理標準實施[9]。分籠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)SPF級動物房，每籠5只，室溫22±2℃，相對濕度為55% ±5%，12 h晝夜交替，自由飲食。先將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，再按照方積乾《衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)》（2012年，人民衛(wèi)生出版社）[10]中隨機數(shù)字表法分為正常組對照組和損傷后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d組，每組6只。

1.1.2 主要試劑及儀器

PI3K（p85）一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），Akt一抗、P-AktSer473一抗、mTOR一抗、P-mTORS?er2448一抗（美國，Cell Signaling），免疫印跡相關(guān)試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），mmobilonTMWest?ern Chemiluminescent HRP Substrate發(fā)光液（美國，MILLIPORE公司），Trizol總RNA提取液、RR037A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、引物合成（日本，TAKARA公司）。電泳儀及電轉(zhuǎn)儀（美國，BIO RAD公司，041BR121545），凝膠圖像掃描及分析系統(tǒng)（北京賽智科技公司），AL204型電子天平（瑞士，METTLER TOLEDO公司），低溫高速離心機（日本，SIGMA 公司），ThermoND2000超微量核酸蛋白測定儀（上海，GENE公司），T100? PCR儀和CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)（美國，BIO RAD 公司），拍攝裝置（日本，OLYMPUS公司，DP73），自制鈍挫傷模型重物打擊裝置。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法

參考Markert[11]的方法，自行設(shè)計鈍挫傷模型重物打擊裝置。打擊參數(shù)：重物220 g，自由下落高度為110 cm，重力為2.16 N，打擊頭面積約為1 cm2，打擊動能為2.37 J。先用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，備皮，俯臥位，將右后肢伸膝，踝背屈90°，稍外展位固定，將造模器打擊頭緊貼腓腸肌肌腹中央偏外側(cè)處，助手將實心鋼球自由下落擊中腓腸肌中段，紅色記號筆標記損傷中心部位（每天加強標記）。造模成功后無皮膚破損和脛腓骨骨折，損傷處先可見局部凹陷，隨后淤腫明顯，且均在腓腸肌的中段。

1.2.2 取材方法

各組在相應(yīng)時間點分別隨機抓取6只大鼠，先用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，右腿保持造模時的姿勢，在損傷處的上方做新標記（以便準確取到損傷組織），沿著新標記下方，用鋒利的一次性刀片迅速取出損傷處腓腸肌組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗。各組的3只大鼠損傷處腓腸肌組織迅速置于液氮罐中1 h后移入-80℃冰箱儲存，進行免疫印跡（Western blot，WB）及逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（ reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測；余下的3只大鼠損傷處腓腸肌組織放入4%多聚甲醛中固定48～72 h，石蠟包埋切片，行HE染色。

1.2.3 HE染色方法

腓腸肌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，橫切4 μm；二甲苯脫蠟后水化，蘇木精染色，鹽酸酒精分化，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以上過程均由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織切片室完成。在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化并采集圖片。

1.2.4 免疫印跡法

分別取各個標本約30～50 mg，剪碎，加入適量蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑后勻漿，配平、4 ℃、12000 r/min、離心15 min，取上清液，得到總蛋白；蛋白定量，取上清液配平后95℃煮沸10 min，使蛋白變性；用BIO RAD標準電泳裝置SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜后分別放入PI3K（p85）（1︰500）、Akt（1︰1000）、P-AktSer473（1︰1000）、mTOR（1︰1000）、P-mTORSer244（1︰1000）和GAPDH（1︰5000）一抗稀釋液中孵育，4℃搖床，過夜；TBST洗膜，加入5%脫脂奶粉稀釋的二抗中，搖床，室溫反應(yīng)1 h；TBST洗膜，加入發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像。Image J對圖像進行定量分析，以GAPDH作為內(nèi)參。用目的條帶光密度值與內(nèi)參條帶光密度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)

分別取各個標本約50 mg，剪碎，加Trizol 1 ml充分勻漿后提取總RNA；檢測總RNA濃度及純度后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟配制10 μl反應(yīng)體系，置于T100?PCR儀中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；按照SYBR Green法配制Mix及反應(yīng)體系后上機進行RT-PCR反應(yīng)；通過CFX manager 3.1軟件讀取Ct值。以 Folds=2-ΔΔCt表示其余5組與正常對照組中目的基因表達的倍比關(guān)系，公式：ΔΔCt=［C（ttarget gene）-Ct（GAPDH）］損傷后1d/3d/5d/7d/14d組-［Ct（target gene）-Ct（GAPDH）］正常對照組，計算平均值。上下游引物序列見表1。

表1 待測基因引物序列

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

由圖1可見：正常對照組腓腸肌肌纖維橫切面呈多邊形，大小一致，排列整齊，分布均勻，胞漿嗜酸性（紅色），細胞核嗜堿性（藍色），分布于肌細胞邊緣（圖1A）；損傷后1 d可見肌細胞變性壞死及明顯的炎性細胞浸潤（圖1B）；損傷后3 d可見新生的成肌細胞和肌管（圖1C）；損傷后5 d可見單核和多核肌管以及大量纖維結(jié)締組織的形成（圖1D）；損傷后7 d和14 d可見新生肌細胞，間質(zhì)中大量膠原纖維形成（圖1E，F(xiàn)）。

圖1 各組大鼠腓腸肌HE染色結(jié)果（×400，標尺=50μm）

2.2 蛋白印跡檢測結(jié)果

由圖2、圖3、表2、表3可見：損傷后各時間點中，PI3K、Akt、P-AktSer473、mTOR、P-mTORSer2448的表達量呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢，在損傷后5 d達到峰值。與正常對照組比較，損傷后1 d、3 d、14 d組各蛋白表達量升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；損傷后5 d組PI3K、Akt、P-AktSer473表達量顯著升高（P＜0.01），mTOR、P-mTORSer2448表達量顯著升高（P＜0.05）；損傷后 7 d組 PI3K、P-AktSer473、mTOR、P-mTORSer2448表達量顯著升高（P＜0.05），Akt表達量顯著升高（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠腓腸肌PI3K、Akt和mTOR的免疫印跡圖

表2 各組大鼠腓腸肌PI3K、Akt和mTOR表達水平比較（n=3）

圖3 各組大鼠腓腸肌p-Akt和p-mTOR的免疫印跡圖

表3 各組大鼠腓腸肌p-AktSer473和p-mTORSer2448表達水平比較（n=3）

2.3 RT-qPCR結(jié)果

表4可見：損傷后各時間點中，MyoD1和MyoG的mRNA表達水平呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢，損傷后3 d達到峰值。與正常對照組比較，損傷后1 d組MyoD1和MyoG的mRNA表達量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；損傷后3 d、5 d、7 d組MyoD1和MyoG的mRNA表達量顯著升高（P＜0.01）；損傷后14 d組myoG的mRNA表達量顯著升高（P＜0.05），myoD1 的mRNA表達量升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠腓腸肌MyoD1和MyoG的mRNA表達水平比較（n=3）

3 討論

急性骨骼肌鈍挫傷是體育運動中十分常見的接觸性、非侵入性的損傷[12]，本實驗?zāi)M此類骨骼肌損傷，以2.37 J的動能打擊大鼠腓腸肌中段后使局部立刻凹陷，而后淤腫明顯，皮溫升高，患肢跛行。HE染色結(jié)果顯示：骨骼肌損傷后1 d，肌細胞變性壞死，炎性細胞潤；損傷后3、5 d可見成肌細胞和新生肌管；損傷后7、14 d可見新生的肌細胞和纖維結(jié)締組織。該結(jié)果與相關(guān)文獻報道具有一致性[5，6]，充分表現(xiàn)了骨骼肌損傷的3個病理進程，即急性損傷炎癥期、修復(fù)期和組織塑形期[13-14]，表明模型的建立是成功的。骨骼肌損傷修復(fù)的病理進程離不開相應(yīng)的基因、蛋白、生長因子及細胞因子等的調(diào)控[15]，同時它們的啟動和傳導(dǎo)又需要信號通路的激活，其中PI3K/Akt/mTOR信號通路作為受體信號向細胞內(nèi)傳導(dǎo)的重要途徑之一，具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及蛋白合成等的功能。

PI3K屬于磷脂酰肌醇激酶[16]，同時具有磷脂酰肌醇激酶及絲/蘇氨酸激酶的活性，是細胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)物質(zhì)。生理條件下，PI3K在細胞內(nèi)表達較少，當細胞受到損傷時，生長因子、細胞因子、激素等細胞外信號分子激活[17-18]，使PI3K表達迅速升高，在細胞膜上促進3，4-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）轉(zhuǎn)變?yōu)樾攀沟鞍祝?，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），從而調(diào)控下游信號分子。蛋白激酶 B（Akt/PKB）是 PI3K的主要下游信號分子，屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，處于PI3K/Akt/mTOR信號通道的核心地位。PI3K激活后在細胞膜上產(chǎn)生了作為第二信使的PIP3，招募含有PH結(jié)構(gòu)域的Akt信號蛋白和磷酸肌醇依耐性蛋白激酶1（PDK1），由PDK1磷酸化Akt的Thr308位點，再通過PDK2二次磷酸化Akt的Ser473位點，從而完全活化Akt[19-20]，激活后的Akt再次轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)，繼續(xù)調(diào)控其下游的靶分子。mTOR是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶（PIKK）家族，是多條信號通路的匯聚點，激活后的Akt可磷酸化mTOR的 Ser2448位點，直接活化mTOR，或通過抑制結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1/2（TSC1/TSC2）而間接激活mTOR，再調(diào)控下游的靶蛋白[21]，從而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。目前，大部分關(guān)于骨骼肌與PI3K/Akt/mTOR信號通路的研究多集中在參與骨骼肌萎縮的代償過程，在骨骼肌損傷修復(fù)中的作用及具體效應(yīng)時間方面鮮有報道[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR信號通路活性變化與骨骼肌鈍挫傷的自我修復(fù)之間存在時間相關(guān)性，各目的蛋白表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在損傷后5 d達到峰值（P＜0.01，P＜0.05）。從損傷后1 d開始該通路被激活，表達高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示骨骼肌細胞接受損傷刺激信號后，在相關(guān)的生長因子、細胞因子以及炎癥刺激的作用下，PI3K/Akt/mTOR信號通路已開始被激活；損傷后的第5 d和7 d，此時模型組PI3K蛋白表達顯著高于正常對照組（P＜0.05），并且模型組Akt和mTOR的總蛋白含量均顯著高于正常對照組（P＜0.05），尤其是能代表該通路激活狀態(tài)的模型組P-AktSer473和P-mTORSer2448也均顯著增加（P＜0.05），雖然本實驗未對P-AktThr308進行檢測，但是只有完全活化的Akt才可激活mTOR的活性，提示PI3K/Akt/mTOR信號通路在骨骼肌損傷修復(fù)的關(guān)鍵時期處于完全激活狀態(tài)，并且HE染色可見大量新生肌管和肌細胞的出現(xiàn)，因此該信號通路參與骨骼肌損傷后相關(guān)蛋白的合成及自我修復(fù)過程；損傷后14 d，該通路活性表達降低，接近正常生理狀態(tài)，組織形態(tài)可見再生的骨骼肌細胞逐漸成熟，瘢痕組織形成，提示骨骼肌損傷修復(fù)進入組織塑形期，該信號通路的作用效應(yīng)降低。

肌衛(wèi)星細胞是一群具有自我更新能力的肌肉前體細胞，在骨骼肌損傷后肌肉組織的修復(fù)中發(fā)揮了重要作用[24-25]。在這一過程中，生肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）扮演了重要的角色，MRFs家族包括了4種肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子：Myf5、MyoD、MyoG、和MRF4，其共同調(diào)控肌細胞的增殖和分化。作為初級分化因子的MyoD（基因名稱為MyoD1）主要調(diào)控成肌細胞的增殖及分化[26]；作為次級分化因子的MyoG調(diào)控新生肌管的終末分化[27]，使新生肌細胞最終轉(zhuǎn)化為表達MyHC的成熟肌管，發(fā)揮骨骼肌纖維的生物學(xué)功能，因此MyoD和MyoG在骨骼肌組織成肌分化中發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果顯示MyoD1和MyoG的mRNA表達也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，均在損傷后3 d達到峰值，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），這一過程表明PI3K/Akt/mTOR信號通路的表達變化與MyoD1和MyoG的mRNA的趨勢大體一致，提示該通路的激活還可調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細胞的增殖與分化，這一點對我們研究骨骼肌損傷修復(fù)進程具有重要意義。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素（rapamycin）抑制 mTORC1信號通路，最終可以抑制成肌細胞的分化[28]；在骨骼肌衛(wèi)星細胞中特異性敲除mTOR會抑制Pax7和成肌因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而抑制肌衛(wèi)星細胞的增殖及分化[29]；并且阻斷PI3K/Akt通路后，成肌分化標志基因 MyoD1、MyoG 和 MyHC的表達可降低，抑制骨骼肌細胞的分化[30]。 本研究的結(jié)果與他人研究基本相符，該信號通路可正向調(diào)控骨骼肌損傷后的成肌分化。

4 結(jié)論

PI3K/Akt/mTOR信號通路在各種細胞中廣泛存在，對細胞的生長、增殖、分化等過程的調(diào)節(jié)具有十分重要的價值。本研究中該通路在骨骼肌損傷后的激活及時程變化趨勢為科學(xué)研究提供了一個新思路，即通過干預(yù)PI3K/Akt/mTOR信號通路的時程變化趨勢，調(diào)控成肌分化標志因子的表達，從而研究加快骨骼肌損傷后修復(fù)的可能生物學(xué)機制。