蘇飛 鄭可 付祎云 吳倩 唐源 王威亞 蔣莉莉

肺癌是世界范圍內致死率最高的惡性腫瘤[1]，也是中國最常見的惡性腫瘤之一。中國每年新發(fā)肺癌病例60.95萬，居惡性腫瘤首位[2]。其中，約80%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者。75%患者確診時已是晚期，失去手術機會[3]。目前，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptortyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）已是攜帶EGFR基因敏感突變的NSCLC患者的一線治療用藥[4-8]。及時、全面了解EGFR突變對NSCLC患者的治療及預后具有重要指導意義。

通過活檢或術后腫瘤組織進行EGFR基因檢測是現(xiàn)行金標準。但是，臨床實踐中存在諸多局限，如：腫瘤組織獲取困難、難以重復取材、以及腫瘤異質性等。液體活檢是指以非侵入性或微侵入性方法，通過對痰液、血液、尿液等體液中的循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell,CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（cell-free DNA, ctDNA）、循環(huán)游離DNA（circulating cell-free DNA, cfDNA）和外泌體等進行檢測，從而獲取腫瘤組織生物學信息的技術[9]。與組織活檢相比，液體活檢具有微創(chuàng)、可重復、患者接受度高等特點。cfDNA是患者血漿中游離的自身DNA片段，由正常及腫瘤細胞壞死、凋亡或主動分泌進入外周血循環(huán)，攜帶生物學信息與原發(fā)腫瘤具有高度一致性[10]。當腫瘤組織難以獲取時，血漿cfDNA檢測是EGFR突變分析合適的替代選擇[11]。對第一代EGFR-TKIs耐藥的肺癌患者中，約50%出現(xiàn)T790M突變。這種耐藥突變可以存在于原發(fā)腫瘤中，更多是出現(xiàn)在治療后二次活檢樣本。顯然，血檢在隨訪、監(jiān)測方面更具有可操作性。

本研究收集肺癌患者配對的血液及腫瘤組織樣本進行EGFR基因檢測分析，旨在探討NSCLC患者血液循環(huán)cfDNA檢測EGFR基因突變的敏感性和特異性，分析其臨床應用以及預后指導價值，為臨床常規(guī)應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料和樣本收集 收集2014年12月-2017年4月四川大學華西醫(yī)院病理科107例肺腺癌患者一一配對的血液和腫瘤組織樣本，所有配對的腫瘤組織樣本均取自輔助治療前。收集并分析患者臨床病理特征，包括：性別、年齡、吸煙史、腫瘤類型、分期、治療方式等資料。入組標準：①病例資料完整；②肝、腎功能及血常規(guī)無明顯異常，無其他并發(fā)惡性腫瘤或器官功能障礙性疾病。③其中，血液樣本包括3組：治療前血液樣本50例，取患者治療前的腫瘤組織標本同時收集血液標本，包括活檢組織［計算機斷層掃描（computed tomography, CT）引導下經(jīng)皮肺穿刺和纖維支氣管鏡活檢］38例和手術切除樣本12例。傳統(tǒng)化療后血液樣本29例，收集患者化療前的活檢腫瘤組織樣本和化療五期后血液樣本；靶向治療后血液樣本28例，收集患者靶向治療前活檢腫瘤組織樣本；對靶向治療的28例腺癌患者全部進行隨訪：隨訪時間：2014年12月-2017年12月；隨訪中位時間19.5個月，隨訪間隔時間3個月；隨訪方式：門診隨訪及電話隨訪；隨訪內容包括臨床癥狀，體格檢查淋巴結情況、腫瘤標志物水平［癌胚抗原（carcino-embryonic antigen,CEA）、細胞角蛋白19片段（cytokeratin-19-fragment,CYFRA21-1）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSE）等］、影像學檢查資料等；根據(jù)隨訪情況，判斷為病情進展時，收集患者血液樣本；其靶向治療平均時間為12個月。

1.2 組織樣本診斷及DNA的提取 107例配對組織樣本均由兩位資深病理醫(yī)師（蔣莉莉副主任醫(yī)師，王威亞副主任醫(yī)師）診斷組織學亞型，必要時行免疫組化協(xié)助確診［廣譜細胞角蛋白（pan-cytokeratin, PCK）、細胞角蛋白7（cytokeratin 7, CK7）、甲狀腺轉錄因子（thyroid transcription factor-1, TTF-1）、天門冬氨酸蛋白酶A（noval aspartic proteinase pepsin family A, Napsin-A）、CK5/6、P63、P40、CD56、嗜鉻素A（chromogranin A, CgA）、突觸素（synaptophysin, Syn）和ki-67］。同時，選擇腫瘤細胞占比10%以上的蠟塊提取DNA。腫瘤組織DNA的提取采用商品化試劑盒（DNA FFPE Tissue Kit, QIAGEN），樣本濃度和純度使用紫外分光光度計檢測，確保光密度（optical density, OD）值在1.8-2.0（A260/A280）之間。合格DNA樣本于-20 ℃環(huán)境保存，檢測時稀釋至2 ng/μL備用。

1.3 血液樣本的收集及DNA的提取 107例血液樣本均于清晨空腹抽取靜脈血10 mL置于K2E（EDTA）抗凝采血管（BD）中，并于30 min內處理：2,000g離心10 min后將上層血漿移至新離心管，再重復2,000g離心10 min提純；獲得的4 mL-5 mL上清血漿標本保存在-80 ℃低溫冰箱，24 h內完成cfDNA提?。ㄑ篋NA提取分離試劑盒，艾德，中國），并于-20 ℃保存待檢。

1.4EGFR基因突變檢測 成功提取DNA后在3 d內進行ARMS法（ABI 7500 real-time PCR儀，美國應用生物公司）檢測EGFR基因突變，包括18-21號外顯子共29個突變熱點（ADx-ARMS，艾德，YZB/國6377-2014）。每次實驗均設各突變陰性、陽性對照孔及空白對照孔，反應參數(shù)依據(jù)試劑盒說明書設定。根據(jù)說明書判定標準對PCR反應擴增曲線及CT值進行分析。

1.5 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 19.0軟件進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，采用方差分析；計數(shù)資料用率（%）表示，應用χ2檢驗對計數(shù)資料進行分析。應用Kaplan-Meier曲線進行生存分析，組間曲線比較采用Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理特征 本組107例肺癌患者的臨床病理特征見表1。其中男女比例為1：1.4；平均年齡58歲（29歲-81歲）；大部分患者無既往吸煙史；超過90%患者屬于肺癌晚期（III期18例，IV期80例）。組織學類型以低分化腺癌為主。

配對107例肺癌患者的血液樣本包括3種情況：①未經(jīng)輔助治療（治療前組）患者樣本50例（46.7%）；②傳統(tǒng)化學治療后（化療組）患者樣本29例（27.1%），包括AC（培美曲塞+卡鉑）化療12例，AP（普萊樂+順鉑）化療17例；③靶向治療（靶向組）患者樣本28例（26.2%），其中以吉非替尼治療24例，特羅凱治療2例，以及凱美納、ADZ9291治療患者各1例。

2.2EGFR總體突變率與類型 107例配對血液和腫瘤組織樣本均成功進行EGFR基因突變分析（ARMS法），與臨床特征分析見表1。統(tǒng)計分析結果顯示，血液和組織EGFR突變均在晚期肺癌患者，尤其是IV期患者中顯著增高（67.5%和87.5%，P＜0.001，P=0.002）；在女性腺癌患者中突變率較高，但差異無統(tǒng)計學意義。

血漿cf DNA檢出EGFR突變60例，總體突變率為56.1%。突變類型以19號外顯子缺失（19 deletion, 19Del）（27例，45%）和21號外顯子突變（L858R）（22例，36.7%）為主；余11例均為雙重EGFR突變（compoundEGFRmutations），包括：19Del T790M雙突變7例（11.7%），L858R T790M雙突變2例，G719X L861Q雙突變和19Del L858R雙突變各1例。

配對腫瘤組織樣本EGFR突變檢出率略高于血液樣本，達77.6%（83例）。突變類型包括19Del 44例（53.0%）、L858R 30例（36.1%）以及少見突變18號外顯子（G719X）突變和20號外顯子插入突變（20-INS）各1例。另檢出雙重EGFR突變7例，包括：19Del T790M雙突變4例（4.8%），19Del L858R雙突變2例和G719X、S768I各1例。

2.3 血液與腫瘤組織EGFR突變結果比較 一一配對比較血液和腫瘤組織樣本的EGFR突變總體情況，完全一致樣本共73例（68.2%），包括49例EGFR突變型和24例野生型。檢測一致的突變類型包括19Del 27例（55.1%），L858R 21例（42.9%），G719X L861Q雙突變1例。不一致病例34例（表2），主要表現(xiàn)為假陰性：血液樣本呈野生型而組織為EGFR突變型（23例，67.6%）。余11例不一致者均屬于EGFR突變類型差異，主要集中在血液樣本T790M的檢出率更高（9例，81.8%）。同時，沒有出現(xiàn)血液樣本假陽性病例。因此，血液cfDNA檢測EGFR基因突變的敏感性為72.3%，特異性為100%。血液檢測EGFR突變型和野生型的一致率分別為81.7%、48.9%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），提示血液檢測EGFR突變陽性結果可能更可靠。19Del和L858R突變的一致率分別為61.4%和70%，兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示血液檢測兩種突變類型均較可靠。

107例血液樣本依據(jù)治療狀態(tài)分為3組（表2）。①50例治療前患者血液樣本檢出EGFR突變31例（62%），配對腫瘤組織EGFR突變39例（78%）。兩者EGFR突變率差異無統(tǒng)計學意義（P=0.081）。配對比較結果發(fā)現(xiàn)完全一致樣本37例（74%，3組中最高）。其中19Del突變12例，L858R突變13例，G719X L861Q雙突變1例和野生型11例。檢測結果不一致樣本13例，同樣集中在假陰性病例（9例，69.2%）。有趣的是，3例患者治療前血檢即發(fā)現(xiàn)含T790M雙突變，而組織檢測陰性。②靶向組患者28例。血液檢出EGFR突變19例（67.9%），配對組織25例（89.3%），兩者差異無統(tǒng)計學意義（P=0.051）。與配對治療前腫瘤組織樣本比較，檢測結果一致樣本16例（57.1%，3組最低），其中19Del突變樣本10例，L858R突變樣本3例，野生型3例。具體分析12例不一致病例發(fā)現(xiàn)：假陰性和檢出含T790M雙突變病例各占一半（表2）。③化療組患者29例。血液檢出EGFR突變10例（34.5%，3組最低），配對治療前腫瘤組織檢出EGFR突變19例（65.5%），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.018）。兩者檢測結果一致樣本20例（65.6%），包括19Del突變5例，L858R突變5例和野生型10例。重要的是9例不一致樣本全部屬于假陰性（表2），提示傳統(tǒng)化療后血液EGFR基因突變檢出率顯著降低。

2.4EGFR基因檢測與靶向治療預后分析 28例肺癌患者經(jīng)靶向治療后檢測血液cfDNA了解EGFR基因狀態(tài)，并全部隨訪；依據(jù)血檢結果分為含T790M雙突變組（6例）和無T790M突變組（13例）：含T790M雙突變組患者平均生存期17.5個月，無T790M突變組平均生存期29.6個月，兩者差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。生存分析如圖1所示，無T790M突變組的無進展生存期（progressionfree survival, PFS）和總生存期（overall survival, OS）均比含T790M雙突變組患者顯著延長。進一步分層分析發(fā)現(xiàn)，無論男性還是女性，無論＜60歲組還是≥60歲組，含T790M雙突變組預后均較差（P=0.005）。

進一步細分血檢結果為19Del突變組、L858R突變組和含T790M雙突變組進行預后分析，發(fā)現(xiàn)19Del突變組患者平均生存期為33.2個月，L858R突變組平均生存時間19個月，含T790M雙突變患者平均生存時間為17.5個月。三者的PFS、OS差異均具有統(tǒng)計學意義（圖2）。但兩兩對比分析發(fā)現(xiàn)，19Del突變患者較L858R突變患者和含T790M雙突變患者靶向治療后PFS和OS明顯延長，而L858R突變與含T790M雙突變患者預后差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

分子靶向治療已成為肺癌患者常規(guī)治療的重要部分。臨床病理多采用侵入性方法，如活檢或手術獲取的組織進行EGFR基因突變檢測[12]。其優(yōu)點毋庸置疑，但缺點同樣不可忽視。一方面，這些侵入性方法都難以重復取材并伴有一定風險[13]，并發(fā)癥可達17%[14]。另一方面，大部分NSCLC患者確診時已是晚期，近1/3患者無法獲得適用于EGFR檢測的組織樣本[15]。此時，血漿cfDNA是肺癌患者EGFR突變檢測的一種有效的替代選擇。近年來，關于這方面的研究呈井噴式發(fā)展。本研究對一組配對血液和腫瘤組織樣本的EGFR基因進行檢測，比其表達差異，分析血液cfDNA是否能準確檢測EGFR基因突變并監(jiān)測耐藥基因T790M的變化，指導患者個體化精準治療。

本研究發(fā)現(xiàn)應用ARMS-PCR法檢測血液cfDNA的EGFR突變總體一致率為68.2%，方法敏感性為72.3%，特異性為100%，比以往的研究[16]更佳。更有意義的是，我們在治療前組獲得血檢和組織檢測最高一致率（74%），最低一致率出現(xiàn)在靶向組（57.1%）。同時，化療組中發(fā)現(xiàn)血液EGFR突變檢出率明顯低于組織（P=0.018），這與以往報道化療后EGFR突變率降低[17]相符。這些數(shù)據(jù)均提示術后輔助治療（傳統(tǒng)化療和靶向治療）可以影響血漿cfDNA構成，為了解殘余腫瘤狀態(tài)提供依據(jù)。

進一步分析血檢和組織檢測不一致病例發(fā)現(xiàn)：①治療前組主要表現(xiàn)為假陰性（57.1%, 8/14），提示血檢作為無法獲得原發(fā)腫瘤組織的替代選擇時應謹慎解釋陰性結果。②靶向組不一致病例一半為假陰性，一半為含T790M雙突變（表2）。同時，生存分析發(fā)現(xiàn)含T790M雙突變組無論在PFS還是OS均差于無突變組（圖1）。因此，血液cfDNA檢測EGFR突變能更好地反映治療現(xiàn)狀并提示預后。另一方面，Camidge等[18]研究發(fā)現(xiàn)接近一半的患者在接受連續(xù)的EGFR-TKI治療后出現(xiàn)繼發(fā)性T790M突變。針對耐藥突變T790M的第三代EGFR-TKI已進入視野，及時檢測以及監(jiān)測用藥后T790M狀態(tài)成為臨床關注新熱點[19,20]。本研究同樣提示血液cfDNA監(jiān)測T790M突變也可作為選擇靶向藥物的指針。③化療組不一致病例全部屬于血檢野生型而治療前原發(fā)腫瘤組織為EGFR突變型，提示血檢應用于傳統(tǒng)化療后的隨訪監(jiān)測可能作用局限。

治療前組有3例血液含T790M雙突變而配對腫瘤組織中陰性的病例以及1個血檢雙突變（19Del、L858R）而組織單突變（L858R）病例。我們分析出現(xiàn)這種情況可能的原因包括：組織活檢取材過程中存在選擇性偏差，因此局部腫瘤組織與外周血所攜帶生物學信息不一致[21]；腫瘤組織的異質性也可能導致與血漿游離DNA信息差異；呈T790M突變的腫瘤細胞亞群均有更高增值指數(shù)，易于侵襲性生長或壞死并釋放DNA入血。因此，本研究提示血漿cfDNA比活檢小組織更能全面反映腫瘤驅動基因狀態(tài)，均化組織異質性造成的檢測偏差，為治療提供更加全面的信息。

表 1 111例肺癌患者配對血液和腫瘤組織樣本的EGFR突變分析Tab 1 Analysis of EGFR mutation in paired blood and tumor tissue samples from 107 patients with lung cancer [n (%)]

表 2 配對血液與腫瘤組織樣本EGFR基因檢測結果不一致病例Tab 2 Inconsistent results of EGFR mutation detection in matched blood and tumor tissue specimen

圖 1 T790M雙突變組和無T790M突變組患者預后分析。A：T790M雙突變組和無T790M突變組PFS比較（P=0.006）；B：T790M雙突變組和無T790M突變組OS比較（P=0.003）。Fig 1 Prognostic analysis of patients with T790M double mutation and no T790M mutation.A: Comparison of progression-free survival (PFS) time between T790M double mutation group and T790M free mutation group survival (P=0.006); B: Comparison of overall survival (OS) time between T790M double mutation group and no T790M mutation group (P=0.003).

圖 2 19Del突變組、L858R突變組和T790M雙突變組患者預后分析。A：19Del突變組、L858R突變組和T790M雙突變組PFS比較（P=0.001）；B：19Del突變組、L858R突變組和含T790M雙突變組OS比較（P＜0.001）。Fig 2 Prognostic analysis of 19Del mutation group, L858R mutation group and T790M double mutation group.A: Comparison of PFS between the 19Del mutation group and the T790M double mutation group (P=0.001); B: Comparison of OS between the 19Del mutation group and the T790M double mutation group (P＜0.001).

分析不同突變類型經(jīng)靶向治療后的無進展生存期和總生存期，并對年齡、性別等方面進行分層對比。結果顯示無T790M突變患者生存期均較突變患者長（PFS及OS），并且不受性別和年齡影響。經(jīng)靶向治療的不同EGFR突變類型患者中，19Del突變預后最佳，較L858R和含T790M雙突變患者PFS和OS明顯延長；而L858R突變型較T790M雙突變型預后稍好，但差異無統(tǒng)計學意義。與本研究一致，有文獻[22-25]報道19Del突變患者靶向治療生存期較L858R突變患者更長。

綜上所述，應用ARMS法檢測血漿cfDNA的EGFR基因突變是一種特異性高、敏感性好的檢測方法，適用于晚期治療前肺癌患者的靶向檢測，是無法獲得組織樣本時合適的替代物。其優(yōu)勢在于能全面反映腫瘤EGFR基因狀態(tài)，減少組織異質性造成的檢測偏倚。同時，適用于應用靶向治療后：①監(jiān)測T790M耐藥突變狀態(tài)，實時反映治療效果，指導用藥；②具有預后價值等。其局限性在于：①需謹慎解釋陰性結果；②傳統(tǒng)化療后可能出現(xiàn)假陰性。全面了解這一檢測方法的優(yōu)缺點，利于臨床選擇開展相應工作及正確解讀結果。