劉磊 黃誠 李力 梁乃新 李單青

肺癌已成為惡性腫瘤相關(guān)死亡主要原因之一[1]，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌的85%。目前，對于早期NSCLC的主要治療方式以手術(shù)為主，但是仍有30%-70%的術(shù)后患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的情況。Ia期、Ib期、IIa期、IIb期及IIIa期NSCLC患者的5年生存率分別為50%、43%、36%、25%及19%[2,3]。腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為NSCLC患者死亡的直接原因。目前針對NSCLC腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的篩查方法均有一定的滯后性和片面性。因此對于NSCLC臨床病理特征全面準(zhǔn)確的評估并根據(jù)此制定有針對性的個體化腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測方案就變得尤為重要。

隨著近幾年對腫瘤基因的研究，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中起著重要的作用。既往研究已發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子受體1（fibroblast growth factor receptor 1, FGFR1）在胃癌、結(jié)直腸癌及骨肉瘤中均有擴(kuò)增表達(dá)[3-5]。最近發(fā)現(xiàn)FGFR1在NSCLC發(fā)生過程中也具有一定作用[6]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)FGFR1與NSCLC鱗癌亞型、男性及吸煙史等臨床特點(diǎn)相關(guān)[7,8]。

在生物技術(shù)發(fā)展的推動下，血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells, CTC）因其實(shí)時、無創(chuàng)、靈敏度高等特點(diǎn)在腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測中得到逐步廣泛的應(yīng)用。Hofman等[2]的一項(xiàng)大樣本前瞻性研究顯示，術(shù)前CTCs值可用來預(yù)測接受根治性手術(shù)切除的I期-II期NSCLC患者的無疾病生存期（disease-free survival, DFS）與總體生存時間（overall survival, OS），對于術(shù)前CTCs＞5個的患者其DFS要更短一些，有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險。

本研究納入了30例NSCLC患者，在術(shù)前1周內(nèi)留取患者外周血，檢測其外周血中CTC數(shù)量，同時對CTC進(jìn)行分型，并在此基礎(chǔ)上檢測不同類型CTC中FGFR1基因表達(dá)的程度，分析不同類型CTC中FGFR1表達(dá)與NSCLC臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

收集北京協(xié)和醫(yī)院胸外科2016年11月-2017年6月30例組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確認(rèn)為NSCLC患者外周血5 mL，并對其進(jìn)行檢測。

1.1 患者篩選

1.1.1 入選標(biāo)準(zhǔn) ①年齡≥18歲，性別不限；②組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)確認(rèn)為NSCLC（腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌等）患者，共留取30例患者標(biāo)本；③初診后未經(jīng)過任何治療（包括術(shù)前化療、手術(shù)等）；④簽署知情同意書。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①術(shù)后組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)為小細(xì)胞肺癌、良性腫瘤等非NSCLC患者；②術(shù)前采集外周血標(biāo)本數(shù)量不足（＜5 mL）；③外周血標(biāo)本不符合檢測要求，發(fā)生溶血、凝血等，影響最終檢測結(jié)果；④已入組患者要求退出試驗(yàn)。

1.2 觀察指標(biāo) ①CTC陽性率，其中包括不同表型（上皮型、混合型及間質(zhì)型）各自陽性率；②FGFR1表達(dá)的程度，包括無表達(dá)、低表達(dá)、中表達(dá)及高表達(dá)；③患者一般情況，包括性別、年齡、吸煙史、腫瘤病史、家族史等；④NSCLC病理檢驗(yàn)情況，包括腫瘤類型、原發(fā)實(shí)體腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。

1.3 CTC分離分型及FGFR1表達(dá)檢測

1.3.1 CanPatrol技術(shù)介紹及CTC檢測原理 該技術(shù)將納米膜過濾技術(shù)和多重RNA原位分析技術(shù)進(jìn)行結(jié)合。首先裂解外周血中的紅細(xì)胞，后利用CTCs與白細(xì)胞的大小差異，采用經(jīng)自主優(yōu)化生產(chǎn)的8 μm孔徑納米膜進(jìn)行過濾及富集。然后通過多重mRNA原位分析（multiple mRNAin situanalysis, MRIA）方法對富集的CTCs進(jìn)行特異性基因核酸定位，達(dá)到對CTCs進(jìn)行分型和鑒定的目的，所用到的核酸及探針序列見表1。RNA探針與目的基因雜交后，通過熒光信號放大體系，提高檢測靈敏度至單拷貝mRNA。本技術(shù)可同時標(biāo)記多種針對CTCs的RNA探針，分別對表達(dá)上皮型基因的CTCs和表達(dá)間質(zhì)型的CTCs進(jìn)行不同熒光染料標(biāo)記，進(jìn)而對其進(jìn)行鑒定和分型。

1.3.2 樣本采集 使用8號采血針和 EDTA抗凝采血管采集外周血樣本并進(jìn)行預(yù)處理。

1.3.3 CTCs富集 將預(yù)處理后的樣本抽濾至過濾器中。

1.3.4 基因探針雜交 使用特異性捕獲探針與目標(biāo)mRNA進(jìn)行雜交。

綜上所述,針對性護(hù)理干預(yù)在老年心肌梗塞便秘護(hù)理中的應(yīng)用效果顯著,癥狀得到改善,提高了護(hù)理效果,針對性護(hù)理干預(yù)值得在老年心肌梗塞便秘護(hù)理中應(yīng)用。

1.3.5 擴(kuò)增探針雜交 使用擴(kuò)增探針與捕獲探針進(jìn)行雜交，為雜交信號的放大做準(zhǔn)備。

1.3.6 信號標(biāo)記探針雜交 使用標(biāo)記有熒光基團(tuán)的標(biāo)記探針與擴(kuò)增探針進(jìn)行雜交，產(chǎn)生熒光信號。

1.3.7 自動識別 利用自動識別系統(tǒng)閱讀熒光信號，自動判斷檢測結(jié)果。

1.3.8 多重RNA原位分析檢測 透化劑孵育5 min，PBS洗滌三次。消化酶孵育60 min，PBS洗滌3次。加入探針工作液，置于（40±1）℃生化培養(yǎng)箱中，孵育3 h。洗滌液洗滌3次。加入預(yù)擴(kuò)增工作液，置于（40±1）℃生化培養(yǎng)箱中，孵育30 min。洗滌液洗滌3次。加入擴(kuò)增工作液，置于（40±1）℃生化培養(yǎng)箱中，孵育30 min。洗滌液洗滌3次。加入顯色工作液，置于（40±1）℃生化培養(yǎng)箱中，孵育30 min。洗滌液洗滌3次。在樣本上加抗淬滅劑（含DAPI）。樣本放置5 min后直接進(jìn)行結(jié)果觀察。結(jié)果分析：采用多重RNA探針，分別針對多種CTCs特異性基因，通過不同顏色熒光信號，可進(jìn)一步將CTCs分型。其中I型CTCs顯示為紅色熒光信號點(diǎn)，III型顯示為綠色熒光信號點(diǎn)，同時表達(dá)I型和III型特異性基因的CTCs為II型（同時顯示紅色熒光及綠色熒光信號點(diǎn)）。CTCs分型標(biāo)準(zhǔn)見表2，鏡下判讀見圖1。

圖 1 鏡下判定三種不同類型的CTC（從左至右）：間質(zhì)型、混合型、上皮型Fig 1 Three different types of CTC under microscope (from left to right): mesenchymal type, mixed type, epithelial type

表 1 CTC分型鑒定所用探針序列Tab 1 Probe sequence used in the identification of CTC classification

1.3.9FGFR1基因表達(dá)檢測 前序步驟同上，在CTC富集的基礎(chǔ)上，應(yīng)用FGFR1捕獲探針及擴(kuò)增探針，利用熒光染料Alexa Flour 647進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記為紫色，捕獲探針及擴(kuò)增探針序列見表3和表4?；虮磉_(dá)程度判定標(biāo)準(zhǔn)為：信號點(diǎn)沒有為無表達(dá)，1個-2個信號點(diǎn)為低表達(dá)，3個-9個信號點(diǎn)為中表達(dá)，≥10個信號點(diǎn)為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析利用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。不同組數(shù)據(jù)之間的關(guān)系應(yīng)用秩相關(guān)并采取Spearman秩相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析。兩組不同數(shù)據(jù)間分布差異性分析采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)方法，多組間數(shù)據(jù)分布差異性分析采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

表 2 CTC分型標(biāo)準(zhǔn)Tab 2 Standard of CTC classification

圖 2 鏡下判定不同分型CTC FGFR1基因表達(dá)情況。間質(zhì)型CTC：A-B：無表達(dá)，C-D：低表達(dá)；混合型CTC：E-F：無表達(dá)，G-H：低表達(dá)，I-J：中表達(dá)；上皮型CTC：K-L：無表達(dá)，M-N：低表達(dá)，O-P：中表達(dá)。Fig 2 The FGFR1 gene expression of different types of CTC under microscope.Mesenchymal CTC: A-B: no expression, C-D: low expression;mixed CTC: E-F: no expression, G-H: low expression, I-J: middle expression; epithelial CTC: K-L: no expression, M-N: low expression, O-P: middle expression.

2 結(jié)果

2.1 入組患者臨床及病理特征 在入組的30例患者中，男性患者18例，女性患者12例。入組患者平均年齡64.5歲。入組患者中，腺癌患者15例，鱗癌患者15例。入組患者中腫瘤分期自I期-IV期均有分布，其中I期患者15例，II期患者5例，III期患者6例，IV期患者4例。入組患者中28例患者外周血中檢測出CTC，CTC數(shù)量自1個-25個不等，平均為6.4個。本組患者中上皮型CTC共檢出71個，平均2.36個，混合型CTC共檢出97個，平均3.23個，間質(zhì)型CTC共檢出25個，平均0.83個，鏡下分型情況見圖2。檢測出的CTC中，F(xiàn)GFR1基因無表達(dá)CTC檢測出151個，低表達(dá)CTC共檢測出16個，中表達(dá)CTC共檢測出12個，高表達(dá)CTC共檢測出14個（圖2）。目前本組患者一般情況及檢測結(jié)果見表5及表6。

表 3 FGFR1捕獲序列Tab 3 FGFR1 capture sequence

3 討論

隨著NSCLC發(fā)病率及死亡率的不斷升高，如何能夠快速準(zhǔn)確的對其進(jìn)行早期診斷并監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移越來越引起人們的關(guān)注。CTC在1869年由Thomas Ashworth首次發(fā)現(xiàn)。隨著CTC檢測技術(shù)的逐漸發(fā)展，發(fā)現(xiàn)CTC與腫瘤的分型、分期、預(yù)后以及轉(zhuǎn)移均有著密切的關(guān)系?，F(xiàn)臨床最常使用的CTC檢測技術(shù)是Cellsearch技術(shù)，是目前唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床CTC檢測的方法，但是該方法在臨床使用上的局限性較大：①該方法只能檢測到帶上皮細(xì)胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）表面抗原的CTC，而CTC會出現(xiàn)丟失EpCAM表面抗原的現(xiàn)象；②不同惡性腫瘤攜帶EpCAM抗原的CTC比例不同，部分癌癥亞型的CTC細(xì)胞表面甚至不表達(dá)EpCAM抗原。其他的CTC分離方法如陰性富集法和ISET方法目前也較為常用，這兩種方法不基于特定的分子標(biāo)志物，因而CTC檢出率相對較高，但僅僅能對CTC進(jìn)行計數(shù)，無法進(jìn)一步對CTC進(jìn)行分型，因而對臨床上進(jìn)行轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)研究幫助非常有限[9,10]。本研究選用CanPatrol技術(shù)對CTC進(jìn)行篩選，該技術(shù)利用納米濾膜及RNA原位雜交方法，能夠在對不同類型的CTC進(jìn)行鑒別同時，對CTC表面不同基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。

表 4 FGFR1擴(kuò)增序列Tab 4 FGFR1 amplification sequence

表 5 入組患者臨床特征Tab 5 Clinical characteristics of patients included

細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）指的是通過調(diào)控細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)，使細(xì)胞更具有侵襲性及遷徙性，這一過程的經(jīng)典理論由Hay[11]在1995年提出。經(jīng)過上述過程后CTC可分為上皮型、間質(zhì)型及混合型三種類型，并且腫瘤細(xì)胞可獲得突破基底膜進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán)的能力，但只有一小部分腫瘤細(xì)胞可最終通過重新轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀け硇停╩esenchymal to epithelial transition, MET）轉(zhuǎn)化為遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移灶。CTC的EMT過程在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起著非常重要的作用。目前已經(jīng)證實(shí)EMT與腫瘤侵襲性、化療藥物耐藥以及較差的臨床預(yù)后相關(guān)[12]。

在對所有數(shù)據(jù)與CTC相關(guān)性進(jìn)行的秩相關(guān)檢驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)CTC陽性率與患者的吸煙史相關(guān)（Spearman系數(shù)=0.434，P=0.016）。根據(jù)Spearman系數(shù)可以看出，既往有吸煙史的患者，血液中CTC陽性率較高，且具有統(tǒng)計學(xué)差異。我們并未在既往文獻(xiàn)報道中檢索到與上述結(jié)果一致的結(jié)論[13]。從表1中不難看出，吸煙的患者均為男性，且秩相關(guān)檢驗(yàn)證實(shí)吸煙與肺鱗癌相關(guān)（Spearman系數(shù)=0.473，P=0.008），這與我們既往所熟知的NSCLC的臨床特點(diǎn)及我國吸煙人群主要以男性為主一致。既往有研究認(rèn)為CTC數(shù)量與NSCLC的病理類型無關(guān)[14,15]。此次秩相關(guān)分析的結(jié)果中我們也并未發(fā)現(xiàn)外周血CTC的陽性率與性別和腫瘤類型相關(guān)（P=0.384,P=0.164），同時，也并未發(fā)現(xiàn)外周血CTC數(shù)量與性別和腫瘤類型相關(guān)（P=0.224,P=0.104）。

在目前的分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，吸煙的患者肺部腫瘤的直徑較大（Spearman系數(shù)=0.412，P=0.024），在將腫瘤直徑的數(shù)據(jù)類型由二分類變量轉(zhuǎn)變?yōu)檫B續(xù)變量再次進(jìn)行秩相關(guān)檢驗(yàn)后，所得到的結(jié)果也證實(shí)了上述的結(jié)果（Spearman系數(shù)=0.396，P=0.030）。結(jié)合不同類型NSCLC的臨床特點(diǎn)進(jìn)行分析，吸煙與肺鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)，肺鱗癌以中央型為主，且往往因出現(xiàn)如咯血、阻塞性肺炎等臨床癥狀時就診，此時腫瘤直徑較大，往往超過3 cm。以往研究認(rèn)為外周血中CTC的數(shù)量與腫瘤的分期相關(guān)[13,15]。相較于早期患者，中晚期的NSCLC患者外周血中更容易檢測出CTC，且數(shù)量更多。但是此次研究中，我們并未發(fā)現(xiàn)CTC陽性率與NSCLC分期之間存在相關(guān)性（Spearman系數(shù)=0.084，P=0.660）。在將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量與其他變量進(jìn)行秩相關(guān)檢驗(yàn)時我們發(fā)現(xiàn)其與性別相關(guān)（Spearman系數(shù)=0.371，P=0.044），即男性患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量更多且具有統(tǒng)計學(xué)差異。Decaluwe等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，即使是臨床分期考慮為I期的NSCLC患者，中央型肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移率更高，更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。結(jié)合本組患者的臨床特點(diǎn)分析，本組男性患者中以中央型肺鱗癌為主，因此出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率更大。

表 6 CTC及FGFR1表達(dá)情況檢測結(jié)果Tab 6 Results of detection for CTC and FGFR1 expression

FGFR1屬于跨膜酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinase, RTK），由胞外區(qū)、跨膜螺旋區(qū)及具有酪氨酸激酶活性的胞內(nèi)區(qū)組成。作為龐大復(fù)雜分子信號系統(tǒng)的一部分，參與細(xì)胞分化、生長、組織發(fā)生發(fā)展、血管生成及傷口愈合等多種過程中[7,8]，且大部分成纖維生長因子（fibroblast growth factor, FGF）通過自分泌或旁分泌的形式發(fā)揮其生理作用。一項(xiàng)包括3,131份腫瘤標(biāo)本及26個癌種的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR1擴(kuò)增率為10%[17]。FGF與FGFR結(jié)合使其磷酸化，進(jìn)而激活包括PI3K、ERK/MAPK及JNK等在內(nèi)的信號通路來產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)[10,18,19]，且上述通路是多種腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及血管生成的中心環(huán)節(jié)。研究認(rèn)為FGF2、FGF9、FGFR1 IIIc及FGFR2 IIIc在NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程中具有一定的作用[7,20-22]。由此可見，越來越多的證據(jù)表明FGF家族與FGFR組成的自分泌和旁分泌系統(tǒng)參與到NSCLC發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)中，并有著重要的作用。

表 7 秩相關(guān)分析列聯(lián)表Tab 7 R×C table of rank correlation

FGFR1在肺鱗癌中FGFR1擴(kuò)增的發(fā)生率在10.7%-20.7%之間[7,8,23-25]，在肺腺癌中發(fā)生率較低，大約在3%左右[8,25,26]。一項(xiàng)納入了329例I期-II期的淋巴結(jié)陰性的NSCLC研究表明，肺鱗癌中FGFR1擴(kuò)增率達(dá)20.7%且具有統(tǒng)計學(xué)意義[8]，且大多數(shù)研究表明FGFR1擴(kuò)增與NSCLC亞型相關(guān)且多發(fā)生于肺鱗癌亞型的患者[8,17,26,27]。多數(shù)研究[8,17,26-29]發(fā)現(xiàn)FGFR1擴(kuò)增狀態(tài)更多見于男性患者，且與吸煙史相關(guān)。也有研究[28]發(fā)現(xiàn)在不同NSCLC亞型的患者中，F(xiàn)GFR1的擴(kuò)增情況與吸煙史無關(guān)。Cihoric等[8]的數(shù)據(jù)表明隨著腫瘤直徑、T分期以及腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期的升高，F(xiàn)GFR1的突變率也在升高，且后者與前三者之間的這一關(guān)系具有統(tǒng)計學(xué)意義。

目前發(fā)現(xiàn)不同類型的CTC在出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者全身治療過程中的藥物敏感性也不同，因此認(rèn)為CTC的分子特點(diǎn)可為腫瘤轉(zhuǎn)移以及抗腫瘤藥物篩選提供新的思路[30]。本組患者利用CanPatrol技術(shù)，在不同類型CTC上檢測FGFR1的表達(dá)程度。根據(jù)不同的表達(dá)程度，將FGFR1分為無表達(dá)、低表達(dá)、中表達(dá)及高表達(dá)。在進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析時我們定義FGFR1低、中、高表達(dá)狀態(tài)為基因表達(dá)狀態(tài)。秩相關(guān)檢驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)FGFR1基因表達(dá)狀態(tài)與本組患者包括腫瘤類型、腫瘤分期、吸煙史等在內(nèi)的臨床特點(diǎn)相關(guān)。利用Mann-Whitney U檢驗(yàn)中也并未發(fā)現(xiàn)不同病理類型的肺癌中FGFR1的表達(dá)存在著差異（P=0.806）。我們認(rèn)為這主要與腫瘤異質(zhì)性相關(guān)，即在原發(fā)腫瘤病灶脫落的CTC細(xì)胞上，F(xiàn)GFR1的表達(dá)與原發(fā)灶之間存在著差異。我們曾假設(shè)在CTC發(fā)生EMT后FGFR1基因的表達(dá)會相應(yīng)增高，或CTC陽性率及數(shù)量較高的患者FGFR1的表達(dá)會相應(yīng)增加，但在秩相關(guān)檢驗(yàn)及Kruskal-Wallis檢驗(yàn)中，我們并未發(fā)現(xiàn)不同類型CTC細(xì)胞中FGFR1的表達(dá)存在差異（P=0.202,P=0.094）。

綜上所述，本研究共納入30例NSCLC患者，在對這30例患者外周血進(jìn)行CTC檢測及分型的基礎(chǔ)上，我們檢測了每位患者CTC上FGFR1表達(dá)的情況。利用秩相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)外周血CTC的數(shù)量與吸煙史相關(guān)，既往有吸煙史的患者外周血CTC數(shù)量相應(yīng)增加，但在進(jìn)一步的分析中并未發(fā)現(xiàn)不同病理類型中外周血CTC的數(shù)量以及CTC上FGFR1基因表達(dá)上有何區(qū)別。FGFR1的表達(dá)水平與外周血CTC數(shù)量并無相關(guān)性，且在不同類型的CTC上FGFR1的表達(dá)情況也并沒有具有統(tǒng)計學(xué)意義的差別。本研究受限于較小的樣本量，我們期待著更大樣本量及納入隨訪數(shù)據(jù)后可得出與CTC及FGFR1基因表達(dá)相關(guān)的更多具有臨床應(yīng)用意義的結(jié)論。