趙辰龍 劉明輝 李永文 張洪兵 李穎 宮顥 袁茵 李偉婷 劉紅雨 陳軍

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)居高不下，特別是在我國(guó)大中城市呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[1-3]。肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過程，涉及多個(gè)基因的異常調(diào)控[4]。近年來，隨著腫瘤研究的深入，眾多的證據(jù)[5,6]顯示，腫瘤的血管生成（angiogenesis）是腫瘤發(fā)展中的一個(gè)重要過程。腫瘤的生長(zhǎng)有兩個(gè)明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段，血管生成使腫瘤能夠獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是促成生長(zhǎng)速度轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。腫瘤的新生血管為不斷侵襲生長(zhǎng)的腫瘤提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)，運(yùn)走代謝廢物，在原位腫瘤的形成和生長(zhǎng)以及在轉(zhuǎn)移瘤的形成中起著十分重要的作用。腫瘤血管生成是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，一般包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞移行、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟[8,9]。腫瘤血管生成的發(fā)生一方面是由于腫瘤細(xì)胞釋放血管生成因子激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，另外一方面腫瘤細(xì)胞也可以招募細(xì)胞外基質(zhì)中的以及宿主細(xì)胞分泌的促血管生成因子，促進(jìn)腫瘤血管生成[5,6]。此外，VEGF/VEGFR信號(hào)通路系統(tǒng)作為一種內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原和促血管生成因子，在原位腫瘤的形成和生長(zhǎng)以及在轉(zhuǎn)移瘤的形成中起著十分重要的作用[7,10,11]。

目前在腫瘤臨床治療中最常用的血管生成抑制劑為貝伐珠單抗，其為第一個(gè)聯(lián)合化療被用于晚期非小細(xì)胞肺癌的血管生成抑制劑[12]。ECOG4599臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定了貝伐珠單抗聯(lián)合鉑類、紫杉醇類化療藥物可用于晚期非鱗的非小細(xì)胞肺癌的一線治療[13]。然而關(guān)于其他的血管生成抑制劑包括：舒尼替尼、索拉非尼和凡德他尼的臨床實(shí)驗(yàn)中均未取得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[10,14]。我們課題組在裸鼠的移植瘤動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，使用細(xì)胞周期抑制劑PD 0332991后，小鼠的移植瘤中微血管生成明顯減少、血管密度顯著低于對(duì)照組[15]，本研究將深入探討PD 0332991對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞的作用，探討PD 0332991通過抑制肺癌微血管形成抑制肺癌進(jìn)展的作用及分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要儀器 EA.hy926人臍靜脈細(xì)胞融合細(xì)胞，購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Life Technologies公司（Carlsbad, CA, USA）Palbociclib（PD 0332991）HCl購自Selleck，MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）試劑購自北京鼎國(guó)公司，EdU試劑盒購自銳博生物公司，細(xì)胞周期及凋亡試劑盒購自BD公司，免疫組化試劑盒、CD34抗體購自北京中杉金橋公司，VEGFR抗體購自Abcam公司，RB抗體，CDK4抗體，E2F1抗體、P-RBser795及P-RBser780抗體均來自Cell Signaling Technology公司（Danvers, MA, USA），CDK6抗體購自Sigma公司（Kansas, Missouri, USA），雙報(bào)告酶標(biāo)儀為tristar LB-941，流式細(xì)胞儀購自Beckman coulter公司（CA, USA）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 EA.hy926細(xì)胞用含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM（dulbecco's modified eagle medium）培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，0.25%胰酶-EDTA（ethylenediaminetetracetic acid）消化傳代，所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。Palbociclib（PD-0332991）HCl溶于于二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide, DMSO）溶液中，藥物處理濃度為IC50濃度或2倍、1/2倍IC50的濃度（根據(jù)實(shí)驗(yàn)不同）處理時(shí)間為48 h。

1.3 MTT分析PD 0332991對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞，按每孔3×104細(xì)胞鋪于96孔板上，過夜待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置分組，除藥物濃度梯度組外，分設(shè)control組（只含細(xì)胞和培養(yǎng)基）和調(diào)零孔組（僅含培養(yǎng)基），PD 0332991藥物各組分別按濃度梯度0、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L遞增，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔液體體積200 μL，于孵育箱分別孵育24 h、48 h、72 h，后每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使得結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)各孔的吸光值（490 nm）。計(jì)算時(shí)每組去掉最大值最小值，細(xì)胞抑制率=（對(duì)照組吸光值-實(shí)驗(yàn)組吸光值）/對(duì)照組吸光值×100%，最終得出PD 0332991作用于EA.hy926 24 h/48 h/72 h的IC50濃度，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4 EdU檢測(cè)PD 0332991對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞DNA復(fù)制的影響 EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能使細(xì)胞在DNA復(fù)制時(shí)，代替胸腺嘧啶（T）滲入正在合成的DNA分子中，基于Apollo?熒光染料與EdU的特異性反應(yīng)即檢測(cè)出DNA復(fù)制活性。細(xì)胞按每孔1×104個(gè)鋪于96孔板上，設(shè)置2組，分別為NC組和PD 0332991=4 μmol/L，每組處理3個(gè)復(fù)孔，其中，NC組只含培養(yǎng)基，PD 0332991組藥物濃度為4 μmol/L，處理48 h后取出，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗1次，5 min，后按Edu試劑盒說明書步驟進(jìn)行處理。

1.5 劃痕及遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PD 0332991對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移力的作用 劃痕實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的EA.hy926細(xì)胞鋪在6孔板上，設(shè)置3個(gè)組，分別為NC組、PD 0332991=6 μmol/L和PD 0332991=12 μmol/L，每組3個(gè)復(fù)孔，直至細(xì)胞生長(zhǎng)到90%的密度，過夜饑餓處理，第2天用無菌的槍頭劃十字，并輕輕洗掉懸浮細(xì)胞，后分別加入2 mL含培養(yǎng)基（5%血清）、含PD 0332991 6 μmol/L、12 μmol/L的培養(yǎng)基，于顯微鏡下隨時(shí)間變化觀察拍照。

遷移實(shí)驗(yàn)：提前用PD 0332991藥物處理處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926細(xì)胞48 h，藥物濃度分別為6 μmol/L、12 μmol/L，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。transwell小室中將提前處理好的3組細(xì)胞（NC、PD=6 μmol/L、PD=12 μmol/L）按密度1×105個(gè)/孔鋪于上室上，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫孵箱培養(yǎng)4 h。取出transwell小室用棉簽小心拭去上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫室溫染色25 min，PBS洗3遍，顯微鏡下觀察下室杯底，選5個(gè)隨機(jī)視野進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。計(jì)算平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，以穿過濾膜進(jìn)入下室杯底的細(xì)胞數(shù)來表示細(xì)胞的遷移能力。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD 0332991對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞周期及凋亡的作用

1.6.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD 0332991對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，按每孔1.5×106個(gè)鋪于6孔板上，分設(shè)3組，分別為NC組、PD 0332991=2 μmol/L和PD 0332991=4 μmol/L，每組3個(gè)復(fù)孔，NC組為空白對(duì)照，只含培養(yǎng)基，處理細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷的1×PBS洗滌收集的細(xì)胞2次，1,500 rpm-2,000 rpm離心5 min，棄上清；少量4 ℃預(yù)冷1×PBS重懸細(xì)胞至單細(xì)胞懸液，逐滴加入4 ℃預(yù)冷的乙醇中（乙醇終濃度為50%-70%），吹打均勻，4 ℃透化過夜；上機(jī)前準(zhǔn)備：6,000 rpm離心透化后的細(xì)胞樣品5 min，棄上清，預(yù)冷的PBS洗滌2次以充分去除殘留的乙醇；500 μL周期染料（BD的PI周期試劑盒-550825）常溫染色15 min-20 min；之后上機(jī)檢測(cè)。

1.6.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD 0332991誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，按每孔1.5×106個(gè)鋪于6孔板上，設(shè)3組，分別為PD 0332991=2 μmol/L、PD 0332991=4 μmol/L以及空白對(duì)照組，處理48 h后正常收集細(xì)胞；4 ℃預(yù)冷的1×Buffer洗滌收集的細(xì)胞2次，1,000 rpm-1,500 rpm離心5 min，棄上清；300 μL 4 ℃預(yù)冷1×Buffer重懸細(xì)胞至單細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC，37 ℃孵育20 min，之后加入5 μL PI，吹打均勻，常溫繼續(xù)孵育10 min之后上機(jī)檢測(cè)。

1.7 免疫組化（IHC） 石蠟包埋的小鼠移植瘤組織見課題組已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道[15]。將石蠟包埋組織以5 μM連續(xù)切片展開，烘干，烤片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)：置0.01 M枸櫞酸緩沖液（PH6.0）中用煮沸，自然冷卻，正常羊血清工作液封閉， 滴加一抗4 ℃孵育過夜，滴加生物素標(biāo)記二抗37 °C 30 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37 °C孵育30 min，PBS沖洗3×5 min。DAB/H2O2反應(yīng)染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。同時(shí)設(shè)置空白陰性對(duì)照，之后計(jì)數(shù)觀察。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印記法（WB）RIPA裂解蛋白，蛋白來自PD 0332991=4 μmol/L、PD 0332991=8 μmol/L處理48 h后的內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置無藥物處理的空白對(duì)照組，于冰上裂解30 min，BCA法測(cè)蛋白濃度，加入5×SDS-PAGE蛋白緩沖液，充分混勻，100 ℃金屬浴加熱變性，取30 μg蛋白上樣，80 V電泳2 h，100 V轉(zhuǎn)膜65 min，含5%脫脂牛奶的1×TBST室溫下，脫色搖床上封閉1 h。加入CDK4/6、RB、P-RBser780、P-RBser795、E2F1、VEGFR抗體，4 ℃孵育過夜，次日用TBST在室溫下脫色搖床上漂洗3次，每次10 min，加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，顯色曝光。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用graphpad prism 6.02軟件統(tǒng)計(jì)分析作圖，實(shí)驗(yàn)中組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式分析軟件采用wincycle 6-16-03-F32。劃痕與Western blot結(jié)果分析采用Image J 1.46r軟件。

2 結(jié)果

2.1 PD 0332991抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果顯示EA.hy926經(jīng)PD 0332991處理24 h、48 h與72 h的IC50分別為（10.279±2.971）μmol/L、（4.241±0.292）μmol/L及（2.574±0.692）μmol/L。EA.hy926細(xì)胞活性隨藥物濃度與時(shí)間梯度增加而降低。EdU染色以檢測(cè)PD 0332991對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的影響，結(jié)果顯示，PD 0332991處理組（PD）陽性細(xì)胞數(shù)為（2.02±1.93），明顯低于對(duì)照組（NC）（77.06±9.19，P＜0.000,2），提示PD 0332991能夠明顯抑制EA.hy926細(xì)胞的增殖（圖1）。

2.2 PD 0332991抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移 分別通過transwell法及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力，PD 0332991處理EA.hy926細(xì)胞后，與對(duì)照組相比較，處理組中穿過膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少（圖2）。進(jìn)一步應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)，不同濃度的PD 0332991（6 μmol/L和12 μmol/L）處理6 h、18 h、32 h后，PD 0332991處理組的EA.hy926細(xì)胞遷移率與對(duì)照組相比明顯下降（P＜0.05），而且隨著PD 0332991藥物濃度的增加，細(xì)胞遷移率下降趨勢(shì)更明顯（圖2）。

2.3 PD 0332991誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2.3.1 PD0332991誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 用PD 0332991=4 μmol/L處理細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，處理組總的凋亡細(xì)胞明顯增加，對(duì)照組與處理組凋亡細(xì)胞占總的細(xì)胞比例分別為（2.79±0.1） 與（20.32±1.23，P＜0.001）； PD 0332991處理組早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞占比分別為（1.95±0.63、8.37±0.59），NC組早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞占比分別為（1.89±0.07、 0.89±0.03），結(jié)果顯示與對(duì)照組對(duì)比，處理組早期凋亡及晚期凋亡率均明顯增加（P＜0.001）。表明PD 0332991能誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞產(chǎn)生凋亡（圖3）。

2.3.2 PD 0332991誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G1期 NC組、PD=2μmol/L、PD=4 μmol/L組，G0/G1期細(xì)胞比例分別為（68.1±1.81）、（75.8±1.2）與（75.73±1.7），NC組vsPD 0332991=2 μmol/L組（P＜0.05），NC組vsPD 0332991=4 μmol/L組（P＜0.05）；G2/M期細(xì)胞占比分別為（21.06±1.7）、（14.8±0.69）與（14±0.26），NC組vsPD 0332991=2 μmol/L組（P＜0.05），NC組vsPD 0332991=4 μmol/L組（P＜0.05）。數(shù)據(jù)顯示PD 0332991處理后，G0期/G1期細(xì)胞比例增多，G2期/M期細(xì)胞比例減少，提示PD0332991誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯于G1期，并減少處于G2期/M期的細(xì)胞。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

圖 1 PD 0332991抑制內(nèi)皮細(xì)胞的活性及增殖。A、B：PD 0332991處理內(nèi)皮細(xì)胞后，細(xì)胞活性隨藥物濃度梯度和時(shí)間梯度降低；C、D：PD 0332991抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖。Fig 1 PD 0332991 inhibited the viability and proliferation of EA.hy926 cells.A, B: After PD 0332991 treatment, cell viability was reduced with the increase of drug concentration and time gradient; C, D: PD 0332991 inhibits the proliferation of EA.hy926 cells.

圖 2 PD 0332991抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。A、B：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PD 0332991對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響；C、D：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PD 0332991對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。Fig 2 PD 0332991 inhibited the migration of EA.hy926 cells.A, B: The effect of PD 0332991 on endothelial cell migration was detected by woundhealing assay; C, D: Transwell migration assay was used to detect the effect of PD 0332991 on endothelial cell migration.

2.4 PD 0332991抑制移植瘤內(nèi)血管新生 肺癌小鼠移植瘤的CD34 免疫組化染色顯示，PD 0332991處理組小鼠的移植瘤瘤體內(nèi)CD34染色密度明顯低于對(duì)照組，NC組與PD 0332991處理組MVD（腫瘤微血管密度）分別為（18.75±2.22）與（13±4,P=0.038）（圖4）。

2.5 PD 0332991降低細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá) 經(jīng)PD 0332991處理的EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞，P-RBser795及P-RBser780的水平明顯降低，同時(shí)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK6、CDK4和E2F1表達(dá)明顯減少（圖5），提示PD 0332991通過抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白而抑制內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)展。

3 討論

圖 3 PD 0332991影響內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡。A-C：應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PD 0332991處理EA.hy926 cells后，G1期細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞凋亡明顯增加。Fig 3 The effects of PD 0332991 on cell cycle and apoptosis.A-C: After treatment with PD 0332991 in EA.hy926 cells, we used flow cytometry to analyze the cell cycle and apoptosis.

圖 4 PD 0332991處理后的小鼠腫瘤血管密度分析。在PD 0332991處理的小鼠肺癌動(dòng)物模型試驗(yàn)中，應(yīng)用CD34抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腫瘤模型中的血管密度明顯降低。Fig 4 Analysis of tumor vascular density in xeongraft mice model treated with PD 0332991.In the mouse model of lung cancer treated with PD 0332991, CD34 antibody detection revealed a marked decrease of vascular density in the tumor tissues.

圖 5 PD 0332991降低細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。在EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞中經(jīng)過PD 0332991處理后，應(yīng)用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞周期相關(guān)諸多蛋白（如CDK6、CDK4、E2F1等）的表達(dá)水平發(fā)生了明顯改變。Fig 5 PD 0332991 reduces cell cycle-related protein expression.After treatment with PD 0332991 in endothelial cells, the expression levels of many proteins associated with the cell cycle (such as CDK6, CDK4,E2F1, etc.) were significantly changed by Western blot.

PD 0332991最早于2001年合成，為低毒的口服劑，能高選擇性地結(jié)合于CDK4和CDK6 ATP結(jié)合口袋，抑制cyclinD-CDK復(fù)合物的活性，因此抑制Rb蛋白的磷酸化而導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯[16,17]。但在早期的臨床試驗(yàn)中，PD 0332991對(duì)腫瘤的治療作用一直存在很多的爭(zhēng)議和不確定性，使其自問世以來，受到的關(guān)注并不多。2009年，F(xiàn)inn等[16]將PD 0332991用于一系列的乳腺癌細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ER陽性的乳腺癌細(xì)胞株對(duì)PD 0332991高度敏感，之后，他們將PD 0332991與來曲唑合用，在12例ER受體陽性的患者中，有3例患者的腫瘤達(dá)到消退30%的療效[18]。而I期/II期臨床試驗(yàn)顯示，較單獨(dú)使用來曲唑組，PD 0332991聯(lián)合來曲唑組PFS顯著延長(zhǎng)（HR=0.488;95%CI： 0.319-0.748）[19]。因此2015年2月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)PD 0332991聯(lián)合來曲唑，用于絕經(jīng)后ER（+）/Her2（-）的乳腺癌的治療。隨后的三期臨床試驗(yàn)更是奠定了PD 0332991聯(lián)合雌激素抑制劑在晚期乳腺癌患者治療中的地位[20,21]。

PD 0332991是細(xì)胞周期蛋白CDK4/6高度選擇性的抑制劑，其發(fā)揮作用主要是通過抑制復(fù)合物CDK4/6-CyclinD1的形成，從而抑制Rb磷酸化使得與其結(jié)合的E2F1轉(zhuǎn)錄因子不能被釋放參與到細(xì)胞周期G1-S期的調(diào)節(jié)，從而使得腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期[17,22,23]。在一二期臨床試驗(yàn)中單用PD0332991在小兒畸胎瘤，套淋巴細(xì)胞瘤，精原細(xì)胞瘤，乳腺癌，以及脂肪肉瘤中彰顯出臨床獲益[23,24]。PD 0332991聯(lián)合用藥更是展現(xiàn)出令人鼓舞的效果，其聯(lián)合蛋白酶體選擇性可逆抑制劑Bortezomib治療骨髓瘤[25]，聯(lián)合布魯頓酪氨酸激酶抑制劑依魯替尼或PI3K抑制劑治療套細(xì)胞淋巴瘤[26,27]，聯(lián)合MEK或BRAF抑制劑治療黑色素瘤和結(jié)直腸癌[28]。特別的在乳腺癌中PD0332991聯(lián)合來曲唑，聯(lián)合氟維司群相對(duì)單用雌激素抑制劑顯著提高病人無進(jìn)展生存期[19,20]。本實(shí)驗(yàn)中在對(duì)PD 0332991在血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926中的研究中發(fā)現(xiàn)，其可以通過抑制細(xì)胞周期于G1期從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖和遷移，進(jìn)而抑制血管的生成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。