薛琳琳 謝麗 宋興國 宋現(xiàn)讓

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其起病隱匿，早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性，大部分患者在確診時已處于局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后往往較差[1,2]。

血小板是起源于骨髓巨核細(xì)胞的多功能無核細(xì)胞碎片，在外周血中其含量僅次于紅細(xì)胞。在腫瘤患者血液循環(huán)中血小板包裹循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells,CTCs）保護(hù)其不受血流剪切力的損傷，并協(xié)助CTCs形成轉(zhuǎn)移。這些受腫瘤 “教育”的血小板（tumor-educated platelets,TEPs）[3,4]的功能發(fā)生了明顯改變，表明其基因的表達(dá)有所改變。Calverley等[5]使用微陣列分析了7名健康個體和5例未治療轉(zhuǎn)移性肺癌患者的血小板mRNAs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)了200個mRNAs的表達(dá)水平有顯著的改變。因為血小板沒有細(xì)胞核，其mRNAs的水平變化不可能是在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)控的，最大的可能是通過轉(zhuǎn)錄后pre-mRNA的剪接成熟及選擇性剪接來實現(xiàn)的[6,7]。凋亡染色體凝聚誘導(dǎo)因子1（apoptotic chromatin condensation inducer 1,ACIN1）是剪接依賴的多蛋白外顯子連接復(fù)合物的一個組成部分，直接參與剪接相關(guān)的mRNAs代謝，TEPs中眾多mRNAs表達(dá)水平的改變預(yù)示著參與mRNAs剪接代謝的蛋白的表達(dá)有可能發(fā)生改變。

本研究通過比較肺癌患者及健康對照血小板ACIN1mRNA的表達(dá)水平，以驗證以上推論，并對其作為肺癌生物標(biāo)志物的潛力進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 一般資料 山東省腫瘤醫(yī)院自2016年12月-2017年4月經(jīng)組織活檢病理證實的首診肺癌患者156例，中位年齡62.5（范圍30-89）歲，男性111例，女性45例。非小細(xì)胞肺癌119例，其中腺癌78例，鱗癌41例，臨床分期I期11例，II期3例，III期40例，IV期65例。小細(xì)胞肺癌37例，其中局限期15例，廣泛期22例。同期體檢健康個體58例為對照組，中位年齡58.5（范圍40-73）歲，男性27例，女性31例。

1.2 總RNA提取及其濃度和質(zhì)量檢測 在實驗前應(yīng)準(zhǔn)備好焦炭酸二乙酯處理水處理好的Ep管、槍頭等器材，避免RNA酶污染。按照InvitrogenTMTRIzolTMReagent操作指導(dǎo)提取總RNA，最終用20 μL無核酶水溶解RNA。用分光光度儀（ASP-3700）分析RNA濃度和純度，RNA瓊脂糖凝膠電泳測RNA的完整性。

1.3 熒光定量RT-PCR檢測ACIN1mRNA的表達(dá) 第一步逆轉(zhuǎn)錄，將PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）試劑盒內(nèi)試劑解凍混勻，配置20 μL反應(yīng)體系，保持37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s合成cDNA。第二步PCR擴(kuò)增，ACIN1上游引物5'-AGGTTAGGCAAGGAGGTGGT-3'，下游引物5'-TGTTCCCAAG AGAAGGCTGT-3'；內(nèi)參ACTB上游引物5'-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3'，下游引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTC-3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成。PCR擴(kuò)增在Roche LightCycler?480上進(jìn)行，每個樣品均做復(fù)孔，PCR擴(kuò)增體系：10 μL FastStart PCR Master（ROCHE）、1 μL Super Green熒光染料（北京金博益生物技術(shù)有限公司）、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、2 μL cDNA溶液、6 μL無核酶水，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性5 sec、60 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸20 s共45個循環(huán)，97 ℃ 5 s、65℃ 1 min、95 ℃ 15 s檢測溶解曲線。繪制熒光擴(kuò)增曲線和溶解曲線，得出Ct值，應(yīng)用ΔCt法（ΔCt=目的RNA Ct值-內(nèi)參RNA Ct值）分析熒光定量PCR結(jié)果，ΔCt值表示目的RNA的相對表達(dá)量，ΔCt值越小表明目的RNA表達(dá)越強(qiáng)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料比較若服從正態(tài)分布用t檢驗并以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；若不服從正態(tài)分布用非參數(shù)檢驗并以中位數(shù)，四分位間距表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC） 曲線，并計算ROC曲線下面積（area under the curve,AUC）以評估指標(biāo)的診斷價值。

2 結(jié)果

2.1 血小板純度檢測 血小板RNA含量遠(yuǎn)少于白細(xì)胞，需盡可能減少白細(xì)胞的數(shù)量以免對血小板RNA譜造成污染。在光學(xué)顯微鏡下用牛鮑計數(shù)板計數(shù)總血小板和白細(xì)胞的數(shù)量證實低速離心法獲得的富血小板血漿純度為每106血小板有0個-5個白細(xì)胞，與文獻(xiàn)報道一致[8]。對全血自然沉降2 h和低速離心法獲得血漿涂片進(jìn)行瑞氏染色在高倍鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)自然沉降獲得血漿在多個高倍鏡視野下均有多少不等的白細(xì)胞出現(xiàn)，而低速離心法獲得的富血小板血漿在多個高倍鏡視野下均無白細(xì)胞出現(xiàn)。見圖1。

2.2 RNA濃度和質(zhì)量檢測 樣品用分光光度計測定D260和D280，D260:D280值均在1.8-2.0之間，此時測定的RNA濃度＞20 ng/μL。取10 μL總RNA溶液進(jìn)行電泳鑒定總RNA完整性，在紫外線下可見18 s及28 s兩條略明亮的條帶，未見5 s處有明亮清晰的條帶。

2.3ACIN1mRNA在肺癌患者與健康對照血小板中表達(dá)水平的比較 腫瘤“教育”血小板RNA譜發(fā)生了明顯改變，可能是通過轉(zhuǎn)錄后pre-mRNA的剪接成熟及選擇性剪接調(diào)控實現(xiàn)的。ACIN1是剪接體的一個組成部分，直接參與剪接相關(guān)的mRNAs代謝，其表達(dá)水平有可能發(fā)生改變。因此我們檢測了156例肺癌患者和58例健康對照血小板中ACIN1mRNA的表達(dá)水平。我們對214例血小板樣本提取總RNA后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，獲得ACIN1及內(nèi)參ACTB的Ct值，并對其求ΔCt值。ACIN1mRNA在肺癌患者血小板中的表達(dá)水平顯著高于健康對照（P=0.015）。ACIN1mRNA在非小細(xì)胞肺癌患者血小板中表達(dá)水平顯著高于健康對照（P=0.022），在小細(xì)胞肺癌患者血小板中的表達(dá)水平高于健康對照但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.058），見圖2。

2.4ACIN1mRNA表達(dá)水平檢測肺癌的效能ACIN1mRNA表達(dá)水平檢測肺癌的ROC曲線AUC為0.608，尤登指數(shù)最大為0.275，此時Δct為13.438，即ΔCt＜13.438時為肺癌。血小板ACIN1mRNA表達(dá)水平檢測129例/156例為肺癌，敏感性為0.827；26例/58例為健康，特異性為0.448，總的準(zhǔn)確性為0.724。見表1。

2.5ACIN1mRNA在肺癌血小板中的表達(dá)與臨床相關(guān)因素分析ACIN1mRNA在肺癌血小板中的表達(dá)與年齡、性別、病理類型以及是否轉(zhuǎn)移等無關(guān)（P＞0.05），見表2。

3 討論

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，5年生存率為17.4%，轉(zhuǎn)移性肺癌患者因錯過了最佳治療時機(jī)，5年生存率只有4.2%[9]。目前，癌胚抗原、糖類抗原125和細(xì)胞角蛋白19片段是肺癌檢測和診斷常用的分子生物標(biāo)志物，但這些生物標(biāo)志物在晚期肺癌診斷中比早期肺癌更準(zhǔn)確[10]。多種基于血液的癌癥相關(guān)生物資源已用于癌癥診斷的研究中，其中基于血液檢測的CancerSEEK評估多種癌癥中循環(huán)蛋白的表達(dá)水平和cfDNA的突變用于癌癥的早期診斷[11]，還包括cfRNA、代謝產(chǎn)物、胞外囊泡和循環(huán)腫瘤細(xì)胞，血小板也成為其中的一員。

表1 ACIN1 mRNA表達(dá)水平檢測肺癌與病理組織檢測肺癌一致性比較Tab 1 Agreement comparison in detecting lung cancer by testing ACIN1 mRNA levels and tumor tissues

表2 ACIN1 mRNA的表達(dá)與臨床相關(guān)因素的關(guān)系Tab 2 Relationships between expression of ACIN1 mRNA and clinical factors

圖1 自然沉降時血漿高倍鏡下（瑞氏染色，100×）觀察到血小板和白細(xì)胞（左），低速離心時血漿高倍鏡下（瑞氏染色，100×）觀察到血小板富集而無白細(xì)胞（右）。Fig 1 Platelets and leukocytes were observed in plasma which was obtained by natural sedimentation (left,Wright’s stain,100×); enriched-platelets without leukocytes were observed in plasma which was obtained by low-speed centrifugation(right,Wright’s stain,100×).

圖2 ACIN1 mRNA在血小板中的表達(dá)水平。A：ACIN1 mRNA表達(dá)水平在肺癌患者和健康對照血小板中的比較；B：ACIN1 mRNA表達(dá)水平在鱗癌和腺癌患者、小細(xì)胞肺癌患者及健康對照血小板中的比較。ΔCt：ACIN1 mRNA的相對表達(dá)量；Health controls：健康對照；LSCC：肺鱗癌；LA：肺腺癌；SCLC：小細(xì)胞肺癌。Fig 2 The expression levels of ACIN1 mRNA in platelets.A:The comparison of ACIN1 mRNA expression levels in platelets between lung cancers and healthy controls; B:The comparison of ACIN1 mRNA expression levels in platelets among squamous cell carcinoma and adenocarcinoma patients,small cell lung cancers patients,and healthy controls.ΔCt:relative expressions of ACIN1 mRNA; LSCC:lung squamous cell carcinoma; LA:lung adenocarcinoma; SCLC:small cell lung cancer.

已有研究[12]表明，血小板是腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、擴(kuò)散、遷移、滲出和建立遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵參與者。血小板RNA對外界刺激做出快速反應(yīng)的動態(tài)特性使得以TEPs RNA表達(dá)譜為基礎(chǔ)的液體活檢用于癌癥診斷成可能。2015年Best等[3]對55例健康個體和228例不同腫瘤類型的癌癥患者（包括非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌和肝膽癌）血小板樣本進(jìn)行RNA測序的研究表明TEP RNA表達(dá)譜發(fā)生改變并可用于癌癥診斷，準(zhǔn)確率為96%。2017年Best等[7]應(yīng)用TEP RNA表達(dá)譜和群體智能算法鑒定非小細(xì)胞肺癌患者和非癌志愿者，準(zhǔn)確率可達(dá)81%。

腫瘤患者外周血中TEPs可能處于“半激活”狀態(tài)[7]，血小板高反應(yīng)性，可啟動血小板內(nèi)信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致血小板pre-mRNA的剪接成熟以及選擇性剪接事件的發(fā)生。研究報道選擇性剪接過程在癌癥中處于紊亂狀態(tài)，一些剪接因子作為癌基因直接促進(jìn)癌癥的發(fā)生和進(jìn)展，其表達(dá)可能上調(diào)或下調(diào)[13]。剪接因子SR（serine and arginine rich）蛋白家族是RNA生成的重要調(diào)控因子，參與RNA的組成型表達(dá)、選擇性剪接、mRNA的轉(zhuǎn)運和翻譯，其中富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子6（serine and arginine rich splicing factor 6,SRSF6）在結(jié)腸癌和肺癌中過度表達(dá)[14]。ACIN1編碼的蛋白通過與AAC-11的相互作用干擾抗癌藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[15]，它還是mTORC1潛在的作用靶點[16]，在血小板中是剪接體的組成部分，參與mRNA剪接相關(guān)的代謝，是腫瘤患者血小板被“教育”的執(zhí)行者之一，其表達(dá)水平可能會發(fā)生改變。本研究分析了146例肺癌患者和58例健康對照ACIN1mRNA在血小板中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ACIN1mRNA在肺癌患者血小板中表達(dá)水平顯著高于健康對照。此外，ACIN1mRNA表達(dá)水平檢測肺癌的敏感性為0.827，特異性為0.448，準(zhǔn)確性為0.724。因此，推論血小板ACIN1mRNA具有作為新的特異性分子生物標(biāo)志物用于肺癌診斷的潛能。

血小板RNA表達(dá)譜是動態(tài)變化的，并與癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，具有成為特異性腫瘤生物標(biāo)志物的潛能，可能為檢測腫瘤、個體化治療以及評估預(yù)后提供指導(dǎo)。