陳閩江 邵池 徐燕 孫雪峰 趙靜 陳勇 趙媛媛 鐘巍 王孟昭

肺癌是最常見導(dǎo)致死亡的惡性腫瘤[1]，發(fā)病時(shí)大多數(shù)患者即存在轉(zhuǎn)移?？v隔淋巴結(jié)活檢對明確診斷和分期至關(guān)重要，在部分患者中可能是唯一的病理診斷和分期依據(jù)。既往縱隔病變主要依靠縱隔鏡或胸腔鏡進(jìn)行活檢，但創(chuàng)傷大，成本高。超聲氣管鏡引導(dǎo)下針吸活檢（endobronchial ultrasound guided tranbronchial needle aspiration,EBUS-TBNA）可在超聲實(shí)時(shí)引導(dǎo)下對大氣道外的縱隔病灶和淋巴結(jié)進(jìn)行活檢，是一項(xiàng)高效微創(chuàng)的檢查手段，且診斷準(zhǔn)確性高和并發(fā)癥發(fā)生率低，在肺癌診斷和分期中得到了廣泛應(yīng)用[2,3]。

近年來，肺癌特別是非小細(xì)胞肺癌的個(gè)體化治療飛速發(fā)展，這對病理診斷和活檢組織的充分性提出了更高的要求。對于晚期非小細(xì)胞肺癌患者，驅(qū)動(dòng)基因突變檢測是指導(dǎo)治療的一個(gè)重要條件。對于存在基因突變的患者，應(yīng)用靶向治療相對于化療療效更佳且毒性作用更低，因此，已經(jīng)在各項(xiàng)國際和國內(nèi)指南中被列為一線治療的首選方案。EBUS-TBNA所取得的活檢組織作為一種小標(biāo)本，可否滿足臨床對于基因檢測的需求，是臨床醫(yī)生關(guān)注的重要問題。

本研究對北京協(xié)和醫(yī)院呼吸科單中心接受EBUSTBNA檢查的肺癌患者進(jìn)行分析，探討EBUS-TBNA標(biāo)本進(jìn)行肺癌診斷和驅(qū)動(dòng)基因檢測的可行性。

1 資料與方法

1.1 入選患者 收集北京協(xié)和醫(yī)院呼吸科自2013年12月-2016年12月臨床考慮為肺癌并進(jìn)行了EBUS-TBNA檢查的患者。入選條件為包括：年齡＞18歲；電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography,CT）或正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像（positron emission tomography,PET）/CT提示縱隔占位性病變或縱隔淋巴結(jié)腫大；臨床懷疑為胸部惡性腫瘤；接受EBUS-TBNA檢查。收集患者的年齡、性別、縱隔淋巴結(jié)分組和大小、EBUS-TBNA穿刺情況（包括穿刺部位、穿刺針數(shù)、不良反應(yīng)）、最終病理診斷以及分子檢測結(jié)果。

1.2 操作方法 檢查在局麻或靜脈中等程度靜麻醉下進(jìn)行。首先進(jìn)行常規(guī)電子氣管鏡（Olympus BF-260）檢查觀察管腔，如可發(fā)現(xiàn)明確新生物，則進(jìn)行活檢；如無明確新生物，或預(yù)計(jì)活檢標(biāo)本不理想，則換用EBUS（超聲氣管鏡：OlympusUC-260-FW；超聲主機(jī)：Olympus EUME1）對影像提示的縱隔病灶依次進(jìn)行超聲檢查，選擇擬穿刺的淋巴結(jié)，并在超聲引導(dǎo)下應(yīng)用22 G穿刺針（一次性細(xì)胞學(xué)穿刺針：22 G-NA-201SX-4022）對目標(biāo)淋巴結(jié)進(jìn)行穿刺活檢。穿刺以獲得明確組織條或4針后停止。對于同時(shí)需要穿刺不同站淋巴的患者，依據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能性由對側(cè)至同側(cè)縱隔肺門淋巴結(jié)依次穿刺并分別送病理。經(jīng)穿刺取得的組織標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定24 h后石蠟包埋切片，穿刺細(xì)胞學(xué)標(biāo)本涂片后應(yīng)用95%乙醇固定，支氣管肺泡灌洗標(biāo)本由病理科經(jīng)離心后涂片固定。對臨床診斷不除外感染的患者在淋巴結(jié)穿刺后進(jìn)行穿刺針沖洗涂片及培養(yǎng)。病理診斷均由病理?？漆t(yī)生出具正式報(bào)告。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 患者最終的診斷確定包括：①惡性腫瘤：必須為病理學(xué)診斷，標(biāo)本來源包括EBUS-TBNA，也包括其他方法，如CT引導(dǎo)下穿刺、胸水細(xì)胞學(xué)、淋巴結(jié)活檢或手術(shù)等；②結(jié)節(jié)?。涸\斷參照中華結(jié)核和呼吸雜志報(bào)道的結(jié)節(jié)病診斷標(biāo)準(zhǔn)；③肺結(jié)核：有明確的抗酸染色陽性或上皮樣肉芽腫伴干酪樣壞死；④非特異性炎性淋巴結(jié)：抗生素治療后明顯縮小或1年隨訪無增大。

1.4 免疫組化及基因檢測 對于常規(guī)染色不能確定病理類型的患者進(jìn)行TTF-1、CK、CEA、P40、P63、Syn等組合進(jìn)一步確定病理分型。對于最終病理為非鱗非小細(xì)胞肺癌的患者加送表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變及間變淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase,ALK）融合基因檢測。EGFR基因突變采用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction,ARMs-PCR，試劑盒theascreen EGFR RGQ PCR Kit），對于腫瘤標(biāo)本要求組織腫瘤細(xì)胞數(shù)大于100個(gè)，經(jīng)提取后腫瘤組織核酸濃度滿足PCR上機(jī)要求者再進(jìn)行檢測。ALK基因應(yīng)用原位免疫熒光雜交（FISH）方法或D5F3抗體免疫組化方法進(jìn)行檢測，對于每個(gè)病例均設(shè)立陽性和陰性對照。FISH方法（試劑盒Vysis LSI ALK Dual Color,Break Apart Rearrangement Probe; Abbott Molecular,Rungis,France）需計(jì)數(shù)至少50個(gè)腫瘤細(xì)胞中大于15%細(xì)胞呈現(xiàn)分離的紅色或綠色信號或單純出現(xiàn)紅色信號提示為陽性結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)算診斷的有效率、敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和組間差異。

2 結(jié)果

2.1 患者基本情況 本組共377例患者進(jìn)行了EBUS-TBNA檢查，其中位年齡58歲，男性213例，女性164例。377例患者共穿刺淋巴結(jié)420組，共計(jì)868針，平均單個(gè)淋巴結(jié)穿刺2.07針。經(jīng)EBUS-TBNA取得病理診斷的肺癌213例，其中腺癌90 例（42%），未分類的非小細(xì)胞肺癌39例（18%），鱗癌 24例（11%），小細(xì)胞肺癌60例（28%）。經(jīng)隨訪及其他活檢方式診斷假陰性淋巴結(jié)30組，假陰性患者26例。不同區(qū)域淋巴結(jié)和不同疾病的EBUS-TBNA診斷準(zhǔn)確性見表1和表2。

EBUS-TBNA診斷的216例腫瘤患者中，共有203（94%）例患者的標(biāo)本進(jìn)行了必要的免疫組化染色，其中199例經(jīng)免疫組化染色后有明確分型診斷。

2.2 非鱗非小細(xì)胞肺癌患者基因檢測情況 經(jīng)EBUS-TBNA診斷的非鱗非小細(xì)胞肺癌共129例，包括腺癌90例和未分類的非小細(xì)胞肺癌39例。其中93例申請了ARMs法EGFR基因突變檢測，其組織足以進(jìn)行檢測的患者為84例（90%），組織標(biāo)本不足以進(jìn)行檢測的9例（10%）。最終檢測結(jié)果顯示EGFR突變陽性的患者為44例（52%），其中19外顯子缺失突變25例（57%），21外顯子21L858R點(diǎn)突變17例（41%），另外檢測到21L861Q突變1例和18 G719X突變1例。

其中111例患者進(jìn)行了ALK融合基因檢測，其中19例應(yīng)用FISH方法進(jìn)行檢測，92例應(yīng)用免疫組化方法進(jìn)行檢測。應(yīng)用FISH方法的檢測成功率為89%，應(yīng)用免疫組化方法檢測的成功率為96%，兩種方法檢測陽性患者分別為1例（6%）和5例（6%）。

部分患者還接受了其他的基因檢測，包括二代測序3例、c-met免疫組化檢測2例、ROS-1融合基因3例及KRAS突變檢測7例。上述患者中，同時(shí)聯(lián)合EGFR和ALK融合基因檢測患者共87例，其中檢測均成功的為79例（90%）。

2.3 EBUS-TBNA組織基因檢測成功的影響因素 組織是否充足是基因檢測能否成功進(jìn)行的重要因素。本研究對可能影響組織充分性，導(dǎo)致檢測不成功的因素進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，穿刺針數(shù)、淋巴結(jié)直徑和淋巴結(jié)部位和與檢測成功率無明顯相關(guān)。腺癌病理類型較非腺癌類型的患者基因檢測成功率高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3-表5）。

2.4 術(shù)前麻醉方式、操作不良反應(yīng)及并發(fā)癥 本研究中患者主要接受的麻醉方式為局麻，其中325例（86%）為局麻下操作。所有接受EBUS-TBNA的患者均未出現(xiàn)死亡、大咯血、支氣管瘺等嚴(yán)重并發(fā)癥。常見的并發(fā)癥狀包括操作后咳嗽、咳痰、少量咯血及低熱，均無需住院治療。

3 討論

對于臨床懷疑胸部惡性腫瘤且合并縱隔淋巴結(jié)腫大的患者來說，取得足夠的病理進(jìn)行診斷尤其重要。微創(chuàng)的活檢方式包括氣管鏡、CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢以及近年來逐漸進(jìn)入使用的EBUS-TBNA。其中后者對于氣管腔外的病灶能在超聲引導(dǎo)下充分取材，與同為微創(chuàng)取材方式的CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢相比，更加有利于腫瘤分期以及反復(fù)操作取得的標(biāo)本，且并發(fā)癥更少[4]。因此，EBUS-TBNA廣泛用于肺癌的分期及縱隔疾病的診斷[5,6]。準(zhǔn)確性方面根據(jù)之前報(bào)道的結(jié)果，與縱隔疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)縱隔鏡相比，EBUS-TBNA可達(dá)到92%的診斷準(zhǔn)確率，其中對于肺癌的診斷準(zhǔn)確率可高達(dá)97%[7]。因此EBUS-TBNA在美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）非小細(xì)胞肺癌指南[8]中被推薦作為肺癌術(shù)前分期的重要手段。

本研究對本中心377例臨床懷疑腫瘤的患者進(jìn)行了分析和隨訪，最終經(jīng)EBUS-TBNA的診斷率與之前報(bào)道相仿，提示EBUS-TBNA對于懷疑胸部腫瘤的患者的明確診斷是一種良好的檢查手段。此外，本研究結(jié)果提示不同穿刺部位的陽性率不同，其中上氣管旁淋巴結(jié)（N2組）、主肺動(dòng)脈窗淋巴結(jié)（N5組）以及縱隔腫物穿刺陽性率相對較低，考慮可能與上述部位的淋巴結(jié)穿刺相對困難相關(guān)、非常規(guī)穿刺取材部位（N5組淋巴結(jié)）[9]、以及穿刺定位標(biāo)志不明確相關(guān)。不同組織類型的肺癌中，小細(xì)胞肺癌的診斷率最高，而非小細(xì)胞未分化癌的診斷率相對較低。考慮與小細(xì)胞肺癌容易表現(xiàn)為縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為相關(guān)。同時(shí)，非小細(xì)胞未分化癌往往由于分化程度更低，免疫組化無典型表現(xiàn)增加了診斷的難度，故診斷率相對較低。

近年來，國際腫瘤協(xié)會對于肺癌的分型分類也進(jìn)行了更新。在小標(biāo)本診斷中，更需要應(yīng)用免疫組化區(qū)分具體病理類型以指導(dǎo)治療。因此，對于肺癌患者，取得活檢組織不僅需要能夠提供腫瘤的病理診斷，還需要提供具體分型的信息。Navavi等[10]報(bào)道了774例小標(biāo)本患者進(jìn)行免疫組化染色后進(jìn)行分型，減少了非小細(xì)胞肺癌組織不明確型的診斷率，也提示了免疫組化對于肺癌分型的重要性。在本研究中經(jīng)EBUS-TBNA診斷的216例腫瘤患者中，94%標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化染色，并明確分型診斷。提示EBUS-TBNA取得的標(biāo)本對于分型診斷的是充足的。

表1 穿刺部位及診斷率Tab 1 Mediastinal lymph node stations and diagnosis accuracy by stations

表2 最終病理診斷Tab 2 Pathology diagnosis

表3 影響EGFR基因檢測成功率的因素Tab 3 Factors affect EGFR genotyping efficacy

肺癌個(gè)體化治療的進(jìn)展還體現(xiàn)在靶向藥物的廣泛應(yīng)用。對于具有基因突變的晚期非小細(xì)胞患者，應(yīng)用靶向治療可延長患者的無進(jìn)展生存時(shí)間且副作用更小[11,12]。因此，EGFR基因突變以及ALK融合基因檢測目前已被NCCN指南推薦為晚期非小細(xì)胞肺癌的常規(guī)檢查項(xiàng)目。因此，應(yīng)用EBUS-TBNA取得的組織是否能足以進(jìn)行基因檢測也引了越來越多的關(guān)注。之前報(bào)道應(yīng)用EBUS-TBNA組織進(jìn)行EGFR基因檢測的成功率為72%-97%不等[13-15]，ALK融合基因的檢測成功率為71%-95%（FISH方法）及近100%（免疫組化方法）[16,17]。但這些研究的病例數(shù)均較少，且大多來自非亞裔人群，本身突變比例較低，不能很好地反映中國人群進(jìn)行EBUS-TBNA取材并進(jìn)行檢測的狀況。

表4 影響ALK基因檢測成功率的因素Tab 4 Factors affect ALK genotyping efficacy

表5 影響EGFR+ALK基因檢測成功率的因素Tab 5 Factors affect double genotyping efficacy

目前，EGFR基因突變的檢測方法包括DNA測序法、PCR法以及二代測序等[18,19]。本研究中應(yīng)用的檢測方法為ARMS法，是一種敏感性和特異性均高的檢測手段[20]。本組患者中共有93例進(jìn)行了EGFR基因突變檢測，檢測成功率為90%，與之前報(bào)道相似。與我院近年來經(jīng)氣管鏡粘膜活檢標(biāo)本進(jìn)行基因檢測的成功率相比，EBUS-TBNA所取得標(biāo)本的檢測成功率更高（分別為90%和85%）[21]。提示EBUS-TBNA與粘膜活檢相比可提供更充足的組織進(jìn)行基因檢測。

針對ALK融合基因檢測，目前NCCN指南[8]推薦的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法為FISH方法，但也同時(shí)提出應(yīng)用應(yīng)用免疫組化方法可以作為ALK融合基因的篩查手段。近年來，多項(xiàng)研究也表明應(yīng)用免疫組化方法的敏感性和特異性可與FISH方法相當(dāng)[22-25]。在Rogers等[24]的研究中提出，應(yīng)用D5F3抗體進(jìn)行免疫組化，檢測ALK融合基因的敏感性可達(dá)100%。由于操作更加簡單，對標(biāo)本量的要求更低，我院目前進(jìn)行的ALK融合基因檢測主要采用D5F3抗體的免疫組化方式。在本研究中進(jìn)行ALK檢測的患者，其中19例進(jìn)行了FISH檢測，其他應(yīng)用免疫組化的檢查方式，應(yīng)用FISH方法和免疫組化方法檢測的成功率分別為89%和98%，最終檢測的陽性率為6%，與之前報(bào)道相當(dāng)。提示應(yīng)用EBUS-TBNA對于ALK融合基因的檢測也能提供充足的組織標(biāo)本。

此外，患者中進(jìn)行聯(lián)合兩項(xiàng)基因檢測組織充足可以完成檢測的比例為92%，進(jìn)行三項(xiàng)檢測檢且組織充足的為58%，提示EBUS-TBNA對肺癌患者的基因分型可提供充足的組織標(biāo)本。

影響基因檢測成功率的因素眾多，包括組織充分性因素以及檢測相關(guān)的因素。本研究對EBUS操作因素和進(jìn)行基因檢測的組織充分性關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果提示穿刺針數(shù)、進(jìn)行穿刺操作的淋巴結(jié)部位和大小不影響進(jìn)行基因檢測的組織充分性?？紤]可能與所有患者均接受較多穿刺數(shù)（平均2.07針）相關(guān)，同時(shí)也提示或許不需要為行基因檢測而對肺癌患者進(jìn)行更多次的穿刺操作且對于CT發(fā)現(xiàn)的縱隔小淋巴結(jié)只要是EBUS-TBNA可穿刺部位，均有可能經(jīng)EBUS-TBNA穿刺取得足夠進(jìn)行病理檢測的組織。此外，不能分類非小細(xì)胞因組織不足導(dǎo)致的基因檢測失敗率更高，可能與不能分類的非小細(xì)胞癌分化更差，需要更多組織切片進(jìn)行多項(xiàng)免疫組化染色相關(guān)。

可行性及安全性方面，本研究中的大多數(shù)患者為局麻下操作，且無人出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。從另一方面說明了EBUS-TBNA是一項(xiàng)便于操作且安全有效的檢查手段。

本研究的不足之處在于因經(jīng)濟(jì)及變更診治地點(diǎn)等因素，部分患者未能進(jìn)行基因檢測。此外，進(jìn)行3項(xiàng)以上基因檢測，以及進(jìn)行KRAS、CMET以及ROS-1等基因檢測的患者例數(shù)較少。今后研究中可前瞻性對所有符合要求的標(biāo)本進(jìn)行多個(gè)基因檢測以充分評估EBUS-TBNA組織用于多基因檢測的充分性。

綜上所述，EBUS-TBNA是一種安全有效的檢查手段。其取得標(biāo)本可滿足非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行包括EGFR以及ALK融合基因在內(nèi)的多項(xiàng)不同類型的基因檢測需要，可作為伴有縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的晚期非小細(xì)胞肺癌患者的活檢手段之一。腫瘤的病理類型是影響檢測成功率的可能因素。