薛佳佳 謝 明 唐 靜 黃 葦 張 琪 侯水生* 盧連水

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；3.河北省肅寧縣農(nóng)業(yè)局，滄州 062350)

蛋氨酸是肉鴨生長發(fā)育所必需的氨基酸，在機(jī)體內(nèi)參與蛋白質(zhì)合成、甲基代謝、生物抗氧化等重要生理生化過程[1-5]。同時(shí)，因肉鴨配合飼料多以蛋氨酸含量較低的玉米、豆粕、雜粕等植物性飼料原料為主，蛋氨酸是肉鴨飼糧的第1限制性氨基酸。因此，生產(chǎn)中需要將晶體蛋氨酸添加到肉鴨飼糧中以滿足肉鴨生長需要。飼糧中添加適宜水平的蛋氨酸可促進(jìn)肉鴨生長、改善胴體品質(zhì)、促進(jìn)羽毛生長[6-8]。然而，蛋氨酸是一種毒性很強(qiáng)的氨基酸。在蛋氨酸水平正常(0.38%)的飼糧中添加1%晶體蛋氨酸可顯著降低21～42日齡北京鴨平均日增重(ADG)和平均日采食量(ADFI)[9]。目前，肉鴨飼糧蛋氨酸安全限量的研究未見相關(guān)報(bào)道，而現(xiàn)已發(fā)表蛋氨酸毒性的研究報(bào)道受飼糧蛋氨酸水平的限制尚少，無法準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)出其安全限量。目前，折線模型已經(jīng)成功應(yīng)用于家禽飼料原料最大安全限量的預(yù)測(cè)[10]。這為蛋氨酸最大安全限量的研究提供了新的統(tǒng)計(jì)方法。同時(shí)，天然存在的蛋氨酸以L構(gòu)型蛋氨酸為主。因此，本試驗(yàn)以晶體L-蛋氨酸為蛋氨酸來源，在蛋氨酸水平滿足肉鴨營養(yǎng)需要的基礎(chǔ)上添加不同水平的晶體L-蛋氨酸，研究飼糧中添加過量蛋氨酸對(duì)7～28日齡北京鴨生長性能和血液指標(biāo)的影響，并通過折線模型預(yù)測(cè)肉鴨飼糧中蛋氨酸最大安全限量，為肉鴨飼糧中晶體蛋氨酸的合理安全使用提供技術(shù)參數(shù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼糧組成

試驗(yàn)采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)6個(gè)飼糧蛋氨酸水平(0.48%、0.73%、0.98%、1.23%、1.48%和1.73%)?；A(chǔ)飼糧主要參考我國《肉鴨飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 2122—2012)配制而成，且蛋氨酸水平(0.48%)滿足育雛期北京鴨正常生長需要，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。通過在基礎(chǔ)飼糧中添加不同水平(0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%和1.25%)的蛋氨酸,配制成6種不同蛋氨酸水平(0.48%、0.73%、0.98%、1.23%、1.48%和1.73%)的試驗(yàn)飼糧。其中，蛋氨酸添加形式為晶體L-蛋氨酸(純度99%)，試驗(yàn)飼糧均制成顆粒飼料。依據(jù)每組每重復(fù)試驗(yàn)鴨初始體重基本一致的原則，將252只7日齡健康雄性北京鴨隨機(jī)分為6個(gè)組，每組7個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只鴨。試驗(yàn)期21 d。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)鴨網(wǎng)上平養(yǎng)，自由采食與飲水，24 h光照。7～28日齡按試驗(yàn)飼糧分組飼養(yǎng)，其他按常規(guī)飼養(yǎng)管理進(jìn)行。

1.3 生長性能測(cè)定

于29日齡早晨，分別稱取各組各重復(fù)鴨只空腹體重和剩余飼料重，計(jì)算7～28日齡鴨平均日增重、平均日采食量和料重比(F/G)。

1.4 血液指標(biāo)測(cè)定

于29日齡早晨，從每組的每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選試驗(yàn)鴨2只，頸靜脈采血6 mL。其中，3 mL置于乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)抗凝管中，用于血液常規(guī)指標(biāo)測(cè)定。另外3 mL置于肝素鈉抗凝管中，3 500 r/min離心15 min，分離血漿，用于血漿生化指標(biāo)的測(cè)定。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 Premix provided the following per kilogram of the diet：Cu 10 mg，F(xiàn)e 60 mg，Zn 60 mg，Mn 80 mg，Se 0.3 mg，I 0.2 mg，氯化膽堿 choline chloride 1 000 mg，VA 10 000 IU，VD33 000 IU，VE 20 IU，VK32 mg，硫胺素 thiamin 2 mg，核黃素 riboflavin 8 mg，VB64 mg，VB120.02 mg，泛酸 pantothenic acid 20 mg，葉酸 folic acid 1 mg，生物素 biotin 0.2 mg。
2)營養(yǎng)水平均為計(jì)算值。Nutrient levels were all calculated values.

血液中血紅蛋白(Hb)含量、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)和紅細(xì)胞體積分布寬度(RDW)等血常規(guī)指標(biāo)采用德國ABX Pentra 120血細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析，試劑盒購自德國ABX公司。

血漿總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿酸(UA)、總膽紅素(TBIL)含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和乳酸脫氫酶(LDH)活性采用HITACHI7080全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行分析，試劑盒均購自四川邁克生物科技股份有限公司。血漿高半胱氨酸(Hcy)含量參考謝明[11]方法采用柱前熒光衍生高效液相色譜法進(jìn)行分析，測(cè)定儀器為Waters 2690液相色譜儀。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.3統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用GLM程序按完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行單因子方差分析。以P<0.05為顯著性水平，運(yùn)用Duncan氏法進(jìn)行平均值之間的多重比較。同時(shí)，依據(jù)Alhotan等[10]的方法，采用折線模型預(yù)測(cè)肉鴨飼糧中蛋氨酸的最大安全限量。

折線模型如下：

y=lx

y=l+u(x-r)x≥r。

式中：y為肉鴨生產(chǎn)性能；x為飼糧蛋氨酸水平(%)；r為蛋氨酸最大安全限量(%)；l為當(dāng)x=r時(shí)肉鴨的生產(chǎn)性能；u為折線模型的斜率；在該模型中，當(dāng)x

2 結(jié) 果

2.1 過量蛋氨酸對(duì)7～28日齡北京鴨生長性能的影響

由表2可知，過量蛋氨酸對(duì)北京鴨末重、平均日增重及平均日采食量均產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。與飼糧蛋氨酸水平為0.48%和0.73%時(shí)相比，飼糧蛋氨酸水平為0.98%時(shí)，北京鴨末重顯著降低(P<0.05)，北京鴨平均日增重和平均日采食量顯著降低(P<0.05)，且隨飼糧蛋氨酸水平的升高而進(jìn)一步顯著降低(P<0.05)。各組間的北京鴨料重比無顯著差異(P>0.05)。

表2 過量蛋氨酸對(duì)7～28日齡北京鴨生長性能的影響Table 2 Effects of excess methionine on growth performance of Peking ducks during 7 to 28 days of age

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。
In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 過量蛋氨酸對(duì)28日齡北京鴨血漿生化指標(biāo)的影響

由表3可知，過量蛋氨酸對(duì)28日齡北京鴨血漿總膽紅素、高半胱氨酸含量及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶活性均產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)，而對(duì)總蛋白、白蛋白、尿酸含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。與飼糧蛋氨酸水平為0.48%時(shí)相比，當(dāng)飼糧蛋氨酸水平為0.98%及以上時(shí)，血漿總膽紅素含量顯著升高(P<0.05)；當(dāng)飼糧蛋氨酸水平為1.23%及以上時(shí)，血漿高半胱氨酸含量顯著升高(P<0.05)，且隨蛋氨酸水平的升高而進(jìn)一步顯著升高(P<0.05)；當(dāng)飼糧蛋氨酸水平為1.73%時(shí)，血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶活性顯著升高(P<0.05)。

表3 過量蛋氨酸對(duì)28日齡北京鴨血漿生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of excess methionine on plasma biochemical parameters of Peking ducks at 28 days of age

2.3 過量蛋氨酸對(duì)28日齡北京鴨血液常規(guī)指標(biāo)的影響

由表4可知，過量蛋氨酸對(duì)28日齡北京鴨血液血紅蛋白含量、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、平均紅細(xì)胞體積和紅細(xì)胞體積分布寬度均產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。與飼糧蛋氨酸水平為0.48%時(shí)相比，當(dāng)飼糧蛋氨酸水平為0.98%及以上時(shí)，血液血紅蛋白含量和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度均顯著降低(P<0.05)；當(dāng)飼糧蛋氨酸水平為1.23%及以上時(shí)，血液平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量顯著降低(P<0.05)；當(dāng)飼糧蛋氨酸水平為1.48%及以上時(shí)，血液紅細(xì)胞體積分布寬度顯著升高(P<0.05)，血液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低(P<0.05)，而血液平均紅細(xì)胞體積顯著升高(P<0.05)。

表4 過量蛋氨酸對(duì)28日齡北京鴨血液常規(guī)指標(biāo)的影響Table 4 Effects of excess methionine on routine blood routine parameters of Peking ducks at 28 days of age

2.4 7～28日齡北京鴨飼糧蛋氨酸的最大安全限量

采用折線模型回歸分析，得到飼糧中蛋氨酸水平(x)與平均日增重(y)的回歸方程：y=79.97-33.41×(x-0.87)(圖1)。由回歸方程可知，7～28北京鴨飼糧蛋氨酸的最大安全限量為0.87%。

圖1 飼糧中蛋氨酸水平與7～28日齡北京鴨平均日增重的回歸關(guān)系Fig.1 Regression relationship between dietary methionine level and average daily gain of Peking ducks during 7 to 28 days of age

3 討 論

3.1 過量蛋氨酸對(duì)7～28日齡北京鴨生長性能的影響

與其他氨基酸相比，蛋氨酸的耐受范圍比較窄，毒性作用比較明顯[12]，因而也獲得了許多研究者的關(guān)注。陳克嶙等[13]在半純合飼糧中添加1.02%DL-蛋氨酸可顯著降低21日齡肉雞體重和飼料轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)引起肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良發(fā)病率顯著升高。Han等[14]以玉米-豆粕型飼糧為基礎(chǔ)飼糧，飼糧中添加1.00%、2.00%和4.00%DL-蛋氨酸均可降低8～22日齡肉雞的平均日增重、平均日采食量和飼料轉(zhuǎn)化效率。Baker等[15]的研究表明，以純合飼糧為基礎(chǔ)飼糧(0.35%蛋氨酸+0.35%半胱氨酸)，飼糧中添加1.75%L-蛋氨酸會(huì)顯著降低肉仔雞的平均日增重和料重比。Xie等[9]研究發(fā)現(xiàn)，無論添加DL-蛋氨酸(1.00%和2.00%)還是等摩爾濃度的DL-羥基類似物游離酸均顯著抑制生長后期北京鴨的平均日增重和平均日采食量。在本研究中，當(dāng)飼糧蛋氨酸水平高于0.98%時(shí)，北京鴨平均日增重和平均日采食量均顯著降低，該結(jié)果與上述研究報(bào)道一致。隨飼糧蛋氨酸水平升高，北京鴨平均日采食量顯著降低，可能是由于過量蛋氨酸競(jìng)爭性抑制與其受體相同的氨基酸的攝取，進(jìn)而引起這些氨基酸在動(dòng)物腦部的耗竭，中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)一步反饋性抑制動(dòng)物采食氨基酸不平衡的飼糧[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，這可能與胰島素水平升高有關(guān)，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[17]。本試驗(yàn)中，北京鴨平均日采食量顯著降低的同時(shí)，平均日增重也顯著下降，而料重比無顯著變化，表明過量蛋氨酸對(duì)肉鴨采食量的抑制作用是其限制肉鴨生長的主要原因。

3.2 過量蛋氨酸對(duì)28日齡北京鴨血漿生化指標(biāo)的影響

血液生化指標(biāo)是反映機(jī)體代謝狀況的重要指標(biāo)，能在一定程度上反映動(dòng)物的生長和健康狀況，已在動(dòng)物生產(chǎn)、營養(yǎng)調(diào)控和疾病診斷等方面得到廣泛應(yīng)用[18-19]。高半胱氨酸是蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物，血漿高半胱氨酸是反映蛋氨酸毒性的敏感指標(biāo)[12]。在本試驗(yàn)中，當(dāng)飼糧蛋氨酸水平為1.23%及以上時(shí)，鴨血漿高半胱氨酸含量顯著升高，這不僅反映出過量蛋氨酸對(duì)肉鴨的毒性，也反映出過量蛋氨酸導(dǎo)致肉鴨體內(nèi)蛋氨酸分解代謝增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致作為中間代謝產(chǎn)物的高半胱氨酸大量堆積。目前醫(yī)學(xué)研究表明，血漿中過高的高半胱氨酸含量是導(dǎo)致人類心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。心腦血管疾病的發(fā)生與高高半胱氨酸含量導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)[20]。在冠心病、腦卒中、急性腦血管病等心血管疾病患者血漿中高半胱氨酸含量顯著高于正常人[21-23]。因此，機(jī)體內(nèi)過高高半胱氨酸含量可能是蛋氨酸導(dǎo)致肉鴨毒性的原因之一。此外，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝細(xì)胞中，正常情況下血液中含量很少，但當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，會(huì)被大量釋放進(jìn)入血液，血液中以上轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高。因此，血液中轉(zhuǎn)氨酶活性是反映肝損傷的靈敏指標(biāo)。同時(shí)，血漿總膽紅素含量是直接膽紅素和間接膽紅素的總和，其含量升高能夠反映肝臟的分泌和排泄功能出現(xiàn)異常[24]。本試驗(yàn)中，過量的飼糧蛋氨酸可導(dǎo)致肉鴨血漿總膽紅素含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高。韓燕云等[17]在過量蛋氨酸對(duì)3～6周齡北京鴨毒性作用的研究中也發(fā)現(xiàn)，過量蛋氨酸在顯著抑制肉鴨生長的同時(shí)，血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著升高。這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致，也進(jìn)一步提示了飼糧中過量蛋氨酸可導(dǎo)致肉鴨肝臟損傷。

3.3 過量蛋氨酸對(duì)28日齡北京鴨血液常規(guī)指標(biāo)的影響

血液是由血漿和血細(xì)胞組成，全血血常規(guī)檢查主要對(duì)機(jī)體血細(xì)胞進(jìn)行的定量檢測(cè)，它能夠很好地反映機(jī)體的健康狀態(tài)。目前，關(guān)于飼糧中蛋氨酸水平對(duì)動(dòng)物血常規(guī)指標(biāo)影響的研究較少。在人類醫(yī)學(xué)中，血紅蛋白含量、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、平均紅細(xì)胞體積和紅細(xì)胞體積分布寬度主要用于貧血的診斷和推斷疾病發(fā)生的原因[25-26]。其中，利用平均紅細(xì)胞體積和紅細(xì)胞體積分布寬度進(jìn)行貧血分類具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值，二者均出現(xiàn)升高時(shí)，常被診斷為“巨幼細(xì)胞性貧血”[26]。巨幼細(xì)胞性貧血，是一種營養(yǎng)不良性貧血，主要是由體內(nèi)葉酸、維生素B12缺乏引起，并伴有高半胱氨酸含量升高[27]。本試驗(yàn)中，飼糧蛋氨酸水平過高會(huì)引起血液血紅蛋白含量、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量顯著降低，平均紅細(xì)胞體積、紅細(xì)胞體積分布寬度顯著升高，這些結(jié)果不僅表明過量蛋氨酸對(duì)肉鴨紅細(xì)胞造成損傷，也表明過量蛋氨酸可能導(dǎo)致肉鴨產(chǎn)生“巨幼細(xì)胞性貧血”。這可能與本試驗(yàn)中攝入過量蛋氨酸肉鴨的血漿高半胱氨酸含量顯著升高密切相關(guān)。在動(dòng)物體內(nèi)，蛋氨酸循環(huán)過程中的再甲基化途徑是實(shí)現(xiàn)高半胱氨酸降解的重要途徑，而該途徑需要葉酸和維生素B12參與。因此，攝入過量蛋氨酸會(huì)導(dǎo)致高半胱氨酸的降解途徑加強(qiáng)，進(jìn)而加大機(jī)體對(duì)葉酸和維生素B12的需求。

3.4 7～28日齡北京鴨飼糧蛋氨酸的最大安全限量

研究表明，飼糧中添加適量的蛋氨酸能顯著提高動(dòng)物的生長性能，改善畜禽產(chǎn)品品質(zhì)，但添加過量蛋氨酸會(huì)抑制動(dòng)物的正常生長，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡[9,28-29]。本研究也顯示，飼糧中添加過量蛋氨酸對(duì)7～28日齡北京鴨有明顯的毒性作用。因此，確定蛋氨酸的最大安全限量對(duì)肉鴨的實(shí)際生產(chǎn)有指導(dǎo)意義。最近，Alhotan等[10]評(píng)估了折線模型在預(yù)測(cè)最大安全限量的有效性，結(jié)果顯示折線模型能更好地預(yù)測(cè)飼料原料的最大安全限量。本研究中，以平均日增重為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用折線模型估測(cè)7～28日齡北京鴨飼糧蛋氨酸的最大安全限量為0.87%。當(dāng)育雛期肉雞飼糧中蛋氨酸水平為0.57、0.46%、0.51%時(shí)，飼糧中添加1.00%蛋氨酸對(duì)肉雞的平均日增重?zé)o顯著抑制作用[15,30-31]。然而，本試驗(yàn)所估測(cè)出的飼糧蛋氨酸最大安全限量低于1.00%，這表明過量蛋氨酸對(duì)育雛期北京鴨生長的抑制作用要強(qiáng)于肉仔雞。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加過量蛋氨酸會(huì)抑制7～28日齡北京鴨的生長，引起血液指標(biāo)異常。以平均日增重為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用折線模型估測(cè)7～28日齡北京鴨蛋氨酸的最大安全限量為0.87%。