周爽男 江茂旺 蔣霞敏 杜學(xué)星 彭瑞冰 韓慶喜

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211)

甜菜堿為季胺型生物堿，廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，因其是從甜菜加工副產(chǎn)品中分離出來而得名[1]。甜菜堿具有改善飼料風(fēng)味、提高動(dòng)物攝食量、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率、減少水質(zhì)污染等優(yōu)點(diǎn)[2]。同時(shí)。甜菜堿還具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腎細(xì)胞的水分滲出、提高鈉鉀泵的功能、調(diào)節(jié)滲透壓、保持維生素效價(jià)、緩解應(yīng)激及作為抗氧化劑使用等功能[3]。甜菜堿作為甲基供體，參與氨基酸的合成和協(xié)同作用，進(jìn)而在組織中對(duì)蛋白質(zhì)合成和能量代謝發(fā)揮重要作用[4]。目前，甜菜堿在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，其作為飼料添加劑對(duì)很多魚類、蝦類具有明顯的誘食作用，如飼料中添加適量的甜菜堿能顯著提高虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[5]、奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×Oreochrmisaureus)[6]、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[7]、羅氏沼蝦(MacrobrachiumRosenbergii)[8]、凡納濱對(duì)蝦(Penaeusvannamei)[9]的增重率，而甜菜堿是否對(duì)養(yǎng)殖貝類攝食及生長(zhǎng)產(chǎn)生影響還有待進(jìn)一步研究。

管角螺(HemifusustubaGmelin)俗稱角螺、響螺、海螺或號(hào)螺，生活在潮下帶近海11～40 m的軟泥和泥沙質(zhì)的海底，主要分布在我國(guó)浙江以南、廣東、廣西和海南沿海[10]。其軟體部肥大，肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美且富含蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，深受國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)歡迎[11]。目前市場(chǎng)上出售的管角螺均捕自沿海海域，近些年隨著管角螺的過度捕撈與海洋環(huán)境的日益惡化，管角螺資源日益枯竭，導(dǎo)致供不應(yīng)求，價(jià)格逐步攀升，因而具有很高的養(yǎng)殖前景。因管角螺屬肉食性動(dòng)物，不喜歡攝食配合飼料，目前養(yǎng)殖管角螺過程中仍以縊蟶、菲律賓蛤仔等雙殼類餌料為主，這就增加了養(yǎng)殖成本。這些貝類易受季節(jié)和禁漁期的影響，不能及時(shí)足量供應(yīng)，因此盡快研制一種管角螺配合飼料誘食劑或添加劑已迫在眉睫。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于管角螺的研究主要集中在種內(nèi)殘殺[12]、養(yǎng)殖技術(shù)[13-14]、營(yíng)養(yǎng)成分[15-16]和生態(tài)習(xí)性[17-18]等方面，而對(duì)管角螺配合飼料添加劑的研究較少報(bào)道，僅見周爽男等[19]不同誘食劑種類對(duì)管角螺幼螺攝食、生長(zhǎng)影響的報(bào)道。因此，本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過在配合飼料中添加不同水平的甜菜堿，探討甜菜堿對(duì)管角螺攝食、生長(zhǎng)性能、組織營(yíng)養(yǎng)成分和消化酶活性的影響，為管角螺配合飼料的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼料制作

以國(guó)產(chǎn)魚粉和秘魯白魚粉為主要蛋白質(zhì)源，α-淀粉為糖源，混合油(魚油∶豆油=1∶1)為脂肪源(金龍魚豆油)，配制7種等氮等脂的試驗(yàn)飼料(粗蛋白質(zhì)含量為47%、粗脂肪含量為7%)。7種試驗(yàn)飼料中甜菜堿的添加水平分別為0(對(duì)照組)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%。試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)用甜菜堿(純度≥98%)和飼料原料均購自寧波天邦股份有限公司。將飼料原料粉碎，粉料過100目篩，按配方比例準(zhǔn)確稱量各種原料及甜菜堿，維生素預(yù)混料和礦物質(zhì)預(yù)混料等微量成分采用逐級(jí)擴(kuò)大法進(jìn)行混合，加入事先加熱溶解的明膠，再加入魚油、豆油，最后加水，用飼料混合機(jī)攪拌混合均勻，成團(tuán)狀，用手動(dòng)絞肉機(jī)擠壓制作成直徑為2 mm、長(zhǎng)度為10～15 mm的長(zhǎng)條，60 ℃烘干，放入保鮮袋中，于-20 ℃冰箱中保存待用。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

續(xù)表1項(xiàng)目 Items甜菜堿添加水平 Betaine supplemental level/%00.20.40.60.81.01.2粗脂肪 Crude lipid6.876.937.116.897.126.976.91粗灰分 Ash9.969.8510.0310.219.8310.1610.08

1)維生素預(yù)混料為每千克飼料提供The vitamin premix provided the following per kg of diets：VA 2 500 IU，VD 500 IU，VE 70 mg，VK325 mg，VB116 mg，VB210 mg，VB618 mg，VB120.05 mg，煙酸 nicotinic acid 50 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 45 mg，葉酸 folic acid 3.5 mg，肌醇 inositol 70 mg。
2)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼料提供The mineral premix provided the following per kg of diets：FeSO4·7H2O 6 mg，CuSO4·5H2O 1.5 mg，MnSO4·H2O 16 mg，ZnSO4·7H2O 20 mg，MgSO4·7H2O 200 mg，CaCl265 mg，CoCl20.02 mg，KI 10 g，Na2SeO30.01 mg。
3)營(yíng)養(yǎng)水平均為實(shí)測(cè)值。Nutrient levels were all measured values.

1.2 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在寧波市象山縣周家村育苗廠進(jìn)行。試驗(yàn)所用管角螺購自浙江省象山縣石浦鎮(zhèn)石浦漁港，試驗(yàn)前先將管角螺放于泡沫箱(58.0 cm×31.5 cm×44.5 cm)中，暫養(yǎng)1周，投喂對(duì)照組飼料至攝食正常，饑餓1 d后開始正式試驗(yàn)。選取630只殼高(7.23±0.25) cm、體重(22.54±0.25) g的管角螺，隨機(jī)分為7組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30只。每組管角螺隨機(jī)飼喂1種試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)所用海水經(jīng)沉淀、沙濾處理，水體高(15±1) cm，水溫(26.5±1.5) ℃，鹽度22±2、pH 7.6～8.2，24 h連續(xù)充氣，溶解氧濃度大于4.0 mg/L。日投餌量為總體重的6%，日投喂2次(06:00、17:00)，投餌后6 h撈取殘餌，烘干并稱重，養(yǎng)殖前期隔天換水1次，換水量100%，養(yǎng)殖中、后期每天換水1次，換水量為50%～100%。試驗(yàn)期60 d。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束饑餓24 h后，以重復(fù)為單位稱重、計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)攝食量，計(jì)算攝食率(feeding rate，F(xiàn)R)、增重率(weight gain rate，WGR)、特定生長(zhǎng)率(specific growth rate，SGR)、飼料效率(feed efficiency，F(xiàn)E)和成活率(survival rate，SR)。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3只螺，分離足部肌肉和肝胰腺，液氮速凍后-80 ℃保存。

1.3.2 肌肉和肝胰腺中營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用凱氏定氮法(GB/T 5009.5—2003)測(cè)定，粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 5009.6—2003)測(cè)定，水分含量采用干燥法(GB/T 5009.3—2003)測(cè)定，粗灰分含量采用高溫灼燒法(GB/T 5009.4—2003)測(cè)定。

1.3.3 肝胰腺消化酶活性分析

將肝胰腺剪碎混合，勻漿后取上清液，分裝后置于-80 ℃保存待用，使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定脂肪酶、胰蛋白酶和淀粉酶活性，測(cè)定步驟按說明書進(jìn)行。

1.3.4 攝食、生長(zhǎng)性能指標(biāo)計(jì)算公式

攝食率[g/(d·只)]=∑(Wfr/N)/t；增重率(%)=100×(M2-M1)/M1；特定生長(zhǎng)率(%/d)=100×(lnM2-lnM1)/t；飼料效率(%)=100×(M2-M1)/Mf；成活率(%)=100×N2/N1。

式中：Wfr為總攝食量(g)；N為每個(gè)泡沫箱養(yǎng)殖管角螺的數(shù)量；t為試驗(yàn)時(shí)間(d)；M1為開始試驗(yàn)時(shí)螺的體重(g)；M2為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)螺的體重(g)；Mf為干物質(zhì)攝入量(g)；N2為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每箱存活的螺個(gè)數(shù)；N1為試驗(yàn)開始時(shí)每箱放入的螺個(gè)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，經(jīng)Excel 2003整理后，用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，再用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，分析組間差異顯著性，顯著水平P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 飼料中添加甜菜堿對(duì)管角螺攝食、生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，隨著甜菜堿添加水平的增加，管角螺的攝食率、增重率、特定生長(zhǎng)率和飼料效率均先增加后降低，甜菜堿添加水平為0.6%時(shí)攝食率、增重率和飼料效率達(dá)到最大值，甜菜堿添加水平為0.4%時(shí)特定生長(zhǎng)率達(dá)最大值。0.6%組的增重率、特定生長(zhǎng)率和飼料效率與0.4%組無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于其他組(P<0.05)，同時(shí)0.6%組的攝食率顯著高于其他組(P<0.05)。甜菜堿添加水平為1.2%時(shí)，增重率、特定生長(zhǎng)率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而攝食率、飼料效率與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。各組成活率無顯著差異(P>0.05)。

表2 飼料中添加甜菜堿對(duì)管角螺攝食、生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of dietary betaine on feeding and growth performance of Hemifusus tuba Gmelin

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。
In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

分別以管角螺的攝食率、增重率、特定生長(zhǎng)率和飼料效率為因變量，甜菜堿添加水平為自變量，由曲線模型擬合回歸方程。由管角螺攝食率(y)與甜菜堿添加水平(x)建立的回歸方程為y=-0.339x2+0.388x+0.529 6(R2=0.964 4)，由方程得出，當(dāng)甜菜堿添加水平為0.57%時(shí)，攝食率達(dá)最大值(圖1)；由管角螺增重率(y)與甜菜堿添加水平(x)建立的回歸方程為y=-45.836x2+50.748x+43.617(R2=0.958 4)，由方程得出，當(dāng)甜菜堿添加水平為0.55%時(shí)，增重率達(dá)最大值(圖2)；由管角螺特定生長(zhǎng)率(y)與甜菜堿添加水平(x)建立的回歸方程為y=-0.497 8x2+0.545 8x+0.606 7(R2=0.970 6)，由方程得出，當(dāng)甜菜堿添加水平為0.55%時(shí)，特定生長(zhǎng)率達(dá)最大值(圖3)；由管角螺飼料效率(y)與甜菜堿添加水平(x)建立的回歸方程為y=-14.372x2+16.316x+30.335(R2=0.939 7)，當(dāng)甜菜堿添加水平為0.57%時(shí)，飼料效率達(dá)最大值(圖4)。

圖1 甜菜堿添加水平與管角螺攝食率的關(guān)系Fig.1 Relationship between betaine supplemental level and FR of Hemifusus tuba Gmelin

2.2 飼料中添加甜菜堿對(duì)管角螺肌肉、肝胰腺中營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表3可知，隨著甜菜堿添加水平的增加，肌肉中粗蛋白質(zhì)含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，在甜菜堿添加水平為0.6%時(shí)達(dá)到最大值，0.2%組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)，但二者均顯著低于其他組(P<0.05)。隨著甜菜堿添加水平的增加，肌肉中粗脂肪含量呈先減少后穩(wěn)定的趨勢(shì)，0.2%組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)，但二者均顯著高于其他組(P<0.05)。肌肉中水分和粗灰分含量各組之間無顯著差異(P>0.05)。肝胰腺中粗蛋白質(zhì)含量隨著甜菜堿添加水平的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，各甜菜堿添加組間無顯著差異(P>0.05)，但均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。肝胰腺中粗脂肪含量則隨著甜菜堿添加水平的增加呈先降低后增加的趨勢(shì)，在甜菜堿添加水平為0.8%時(shí)達(dá)到最小值，且各甜菜堿添加組均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。肝胰腺中水分和粗灰分含量各組之間無顯著差異(P>0.05)。

圖2 甜菜堿添加水平與管角螺增重率的關(guān)系Fig.2 Relationship between betaine supplemental level and WGR of Hemifusus tuba Gmelin

圖3 甜菜堿添加水平與管角螺特定生長(zhǎng)率的關(guān)系Fig.3 Relationship between betaine supplemental level and SGR of Hemifusus tuba Gmelin

圖4 甜菜堿添加量與管角螺飼料效率的關(guān)系Fig.4 Relationship between betaine supplemental level and FE of Hemifusus tuba Gmelin

表3 飼料中添加甜菜堿對(duì)管角螺肌肉、肝胰腺中營(yíng)養(yǎng)成分的影響Table 3 Effects of dietary betaine on nutritional components in muscle and hepatopancreas of Hemifusus tuba Gmelin %

2.3 飼料中添加甜菜堿對(duì)管角螺肝胰腺消化酶活性的影響

由表4可知，隨著甜菜堿添加水平的增加，肝胰腺中脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶活性均呈先升高后降低的趨勢(shì)，0.2%～1.0%組均顯著高于對(duì)照組和1.2%組(P<0.05)。甜菜堿添加水平為0.6%時(shí)，管角螺肝胰腺中脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶活性均最高，除脂肪酶、淀粉酶活性與0.4%和0.8%組無顯著差異(P>0.05)外，脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶活性均顯著高于其他各組(P<0.05)。

表4 飼料中添加甜菜堿對(duì)管角螺肝胰腺消化酶活性的影響Table 4 Effects of dietary betaine on digestive enzyme activities in hepatopancreas of Hemifusus tuba Gmelin U/g prot

3 討 論

3.1 飼料中添加甜菜堿對(duì)管角螺攝食、生長(zhǎng)性能的影響

甜菜堿是一種季胺型生物堿，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與甘氨酸相近，味甜稍苦，能產(chǎn)生魚類、甲殼類等水產(chǎn)動(dòng)物所喜愛的獨(dú)特風(fēng)味，從而對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的嗅覺、味覺形成刺激，使水產(chǎn)動(dòng)物的消化腺分泌增強(qiáng)，進(jìn)而攝食率大大增加[20]。同時(shí)，甜菜堿能掩蓋配合飼料的不適口味，促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物攝取不喜食的營(yíng)養(yǎng)成分，減少餌料消耗，提高飼料轉(zhuǎn)化率，因而甜菜堿在水產(chǎn)養(yǎng)殖中是一種非常有效的化學(xué)誘食劑[21]。有研究表明，甜菜堿能使水產(chǎn)動(dòng)物三碘甲狀腺原氨酸(T3)和胰島素的分泌增加，通過神經(jīng)-內(nèi)分泌水平調(diào)控機(jī)體代謝活動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)甜菜堿促進(jìn)生長(zhǎng)的功能[22]。與在軍曹魚(Rachycentroncanadum)[23]、露斯塔野鯪(Labeorohita)[24]、大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)[25]等魚類上得出的結(jié)果類似，本試驗(yàn)結(jié)果顯示甜菜堿對(duì)管角螺也有很強(qiáng)的誘食作用，在0～0.6%范圍內(nèi)，隨著甜菜堿添加水平的增加，管角螺的攝食率、增重率、特定生長(zhǎng)率和飼料效率均逐漸增加，且與對(duì)照組有顯著差異，說明在此添加范圍內(nèi)甜菜堿添加水平越高，對(duì)管角螺嗅覺和味覺形成的刺激越強(qiáng)，采食量就越大。

在動(dòng)物體內(nèi)，甲基供體一般不能被合成，必須從外界補(bǔ)充。而甲基是動(dòng)物體內(nèi)各種物質(zhì)代謝不可缺少的重要物質(zhì)，甲基化反應(yīng)在神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)中都具有十分重要的作用。甲基供體如果不足或過多，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生長(zhǎng)紊亂和發(fā)生病變[26]。甜菜堿是一種高效的甲基供體，能提供有效的活性甲基，節(jié)約氨基酸而使更多的氨基酸用于體蛋白質(zhì)的合成[27]。但有研究結(jié)果表明，當(dāng)飼料甜菜堿添加水平超過一定值后，其對(duì)黃鱔(Monopterusalbus)[28]和短蓋巨脂鯉(Colossmabrachypomum)[29]的促生長(zhǎng)效果會(huì)迅速下降。本試驗(yàn)中，當(dāng)甜菜堿添加水平超過0.6%之后，管角螺的攝食率和增重率便逐漸降低，說明0.6%的添加水平已經(jīng)可以滿足管角螺的生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)需要和代謝穩(wěn)定。尤其是當(dāng)甜菜堿添加水平為1.2%時(shí)，管角螺的攝食率和增重率均不如未添加甜菜堿的對(duì)照組，說明過量添加的甜菜堿已經(jīng)抑制了管角螺的生長(zhǎng)。

甜菜堿除了具有促食作用，還能增強(qiáng)一些水生動(dòng)物的免疫能力，預(yù)防疾病，提高成活率，如飼料添加甜菜堿能顯著提高白梭吻鱸(Sanderlucioperca)[30]、黃鱔[28]的存活率。在本試驗(yàn)中，飼料添加甜菜堿并未對(duì)管角螺的成活率產(chǎn)生顯著影響，在對(duì)庫圖擬鯉(Rutilusfrisiikutum)[31]、奧利亞羅非魚(Oreochromisaureus)[32]的研究中也得出相似結(jié)論，說明甜菜堿對(duì)水生動(dòng)物存活率的影響因種而異。

3.2 飼料中添加甜菜堿對(duì)管角螺組織營(yíng)養(yǎng)成分含量的影響

甜菜堿除了對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物有促生長(zhǎng)作用外，還具有改善水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體營(yíng)養(yǎng)組成，提高肉質(zhì)的功能。例如，投喂里海擬鯉(Rutilusrutiluscaspicus)適量的甜菜堿，其肌肉中粗蛋白質(zhì)含量顯著升高[33]；黃鱔肌肉和肝臟中粗脂肪含量隨甜菜堿添加水平的增加而逐漸下降[34]；飼料中添加0.01%的甜菜堿能顯著降低異育銀鯽肌肉和肝臟中粗脂肪含量，當(dāng)甜菜堿添加水平為0.10%時(shí)，異育銀鯽血清中甘油三酯和總膽固醇含量分別降低7.23%和15.86%[35]。本試驗(yàn)中，飼料添加甜菜堿對(duì)管角螺肌肉與肝胰腺中水分和粗灰分含量均無顯著影響，但粗蛋白質(zhì)含量有一定程度的上升，粗脂肪含量有一定程度的下降，這是因?yàn)椋阂环矫妫鸩藟A能合成磷脂酰膽堿參與動(dòng)物體內(nèi)的脂肪運(yùn)輸，還能通過提供甲基代替蛋氨酸參與脂肪代謝，而蛋氨酸的供甲基消耗降低了，就能合成更多的蛋白質(zhì)；另一方面，甜菜堿能增加高半胱氨酸-S-基轉(zhuǎn)移酶的活性，促進(jìn)了高半胱氨酸向機(jī)體必需氨基酸——蛋氨酸的轉(zhuǎn)化，蛋氨酸主要用于蛋白質(zhì)的合成，因此甜菜堿起到了凈增蛋氨酸的功效[26]。此外，甜菜堿還可以加速機(jī)體內(nèi)細(xì)胞線粒體中脂肪酸的氧化過程，提高肌肉和肝胰腺中長(zhǎng)鏈酯酰肉堿的含量及長(zhǎng)鏈酯酰肉堿與游離肉堿的比例，促進(jìn)脂肪分解，減少體脂肪沉積，有效地減少水產(chǎn)動(dòng)物脂肪肝的發(fā)生[22,36]。因此，甜菜堿的添加促進(jìn)了動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成和沉積以及脂肪的分解。

3.3 飼料中添加甜菜堿對(duì)管角螺肝胰腺消化酶活性的影響

4 結(jié) 論

① 飼料中添加適宜水平的甜菜堿能夠促進(jìn)管角螺攝食，提高肌肉和肝胰腺中粗蛋白質(zhì)含量，降低肌肉和肝胰腺中粗脂肪含量，提高肝胰腺中脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶的活性，從而有利于管角螺的健康生長(zhǎng)。

② 以增重率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，經(jīng)經(jīng)二次回歸分析可知，管角螺飼料中甜菜堿的適宜添加水平為0.55%。