李欣虹 鄭若愚 辜彥霏 陶思邑 任志華 王亞超 鄧俊良*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，成都 611130；2.西南科技大學(xué)，綿陽 621010)

玉米赤霉烯酮(ZEA)又稱F-2毒素，是由鐮刀菌(主要是禾谷鐮刀菌，此外還有三線鐮刀菌、木賊鐮刀菌、雪腐鐮刀菌以及粉紅鐮刀菌等)產(chǎn)生的一種類雌激素樣霉菌毒素，在霉變的谷類作物和動物性食品中廣泛存在。ZEA可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Kim等[1]研究發(fā)現(xiàn)，ZEA可導(dǎo)致小鼠精細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p害，出現(xiàn)不同程度的凋亡小體，且隨著作用時間延長和濃度增加而加重，精原細(xì)胞和精母細(xì)胞表現(xiàn)更明顯。余增麗等[2]對乳腺癌的MCF-7細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)ZEA對細(xì)胞的增殖活性是通過調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)基因和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)基因的表達(dá)抑制了細(xì)胞凋亡所獲得的，且ZEA可以顯著提高細(xì)胞色素P450家族1亞科A多肽1(CYP1A1)酶的活性及其mRNA表達(dá)。鄧友田等[3]也研究得出ZEA能夠促進(jìn)Bc1-2 mRNA和蛋白表達(dá)，而抑制Bax的表達(dá)，ZEA可提高人乳腺癌細(xì)胞系——MCF27細(xì)胞增殖活力并促進(jìn)有絲分裂指數(shù)，并通過對Bc1-2和Bax表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，抑制雌激素耗盡所誘導(dǎo)的MCF27細(xì)胞凋亡。符達(dá)[4]給大鼠飼喂不同劑量的ZEA發(fā)現(xiàn)，ZEA可對大鼠p53基因第8外顯子的構(gòu)象產(chǎn)生影響，導(dǎo)致外顯子中2個條帶上堿基對出現(xiàn)以嘧啶與嘌呤的互換突變?yōu)橹鞯耐蛔儭６鴓53基因與細(xì)胞周期生長的調(diào)節(jié)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)、DNA復(fù)制及誘導(dǎo)程序性死亡有密切關(guān)系，p53基因通過Bal-2家族作用調(diào)控細(xì)胞凋亡[5]。在Yu等[6]關(guān)于ZEA誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞死亡機制的研究中，ZEA染毒處理導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位的損失及Bcl-2和Bax蛋白在線粒體的變化，細(xì)胞質(zhì)釋放細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子，過氧化氫酶抑制ZEA誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞減少。

ZEA作用于免疫系統(tǒng)的主要靶器官是脾臟，可導(dǎo)致脾臟淋巴細(xì)胞凋亡，進(jìn)而使機體免疫功能降低。馬勇江等[7]研究ZEA對離體培養(yǎng)脂多糖活化小鼠脾臟淋巴細(xì)胞具有顯著促凋亡作用，且促進(jìn)強度與其劑量呈依賴性關(guān)系。但目前關(guān)于ZEA對雞脾臟細(xì)胞凋亡方面的研究較少。因此，本研究以原代培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞為模型，從細(xì)胞水平上研究鐮刀菌毒素ZEA染毒對雞脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡及其調(diào)控基因的影響，以便闡明ZEA染毒對雞脾臟淋巴細(xì)胞的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物中心提供的40～60日齡健康的伊莎公雞。

胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、ZEA及無酚紅的RPMI1640培養(yǎng)基均購自Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒[用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)雙染]購自ACTGene公司；2′,7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)與羅丹明123(Rh123)購自Sigma公司；Trizol試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA抽提試劑盒及RNA酶均購自Invitrogen公司；rTaq酶等PCR反應(yīng)試劑購自TaKaRa(大連)生物公司；溴化乙錠(EB)購自Sigma公司；雞的Bax、Bak-1、Bcl-2、p53及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒均購自上海生工生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 脾臟淋巴細(xì)胞懸液的制備、培養(yǎng)及處理

在無菌條件下，將雞脾臟取出，放入盛有磷酸鹽緩沖液(PBS)的培養(yǎng)皿里，用PBS輕輕洗滌脾臟周圍的血液殘渣，仔細(xì)剝?nèi)テ⑴K周圍結(jié)締組織，將其移入另一個盛有PBS并浸泡有200目網(wǎng)篩的培養(yǎng)皿中，用鑷子將脾臟放在200目銅網(wǎng)上，用20 mL一次性注射器的內(nèi)芯輕輕研磨，過濾，將濾液適當(dāng)稀釋成一定濃度的細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液移入預(yù)先裝有雞淋巴分離液離心管里，即緩緩以1∶1體積比將細(xì)胞懸液移入到雞淋巴分離液上層，2 000 r/min常溫離心15 min，用巴氏吸管移取淋巴細(xì)胞，加入冷的PBS洗滌，1 500 r/min 4 ℃離心5 min，棄去上清液，加入不含毒素的RPMI1640完全培養(yǎng)液(加FBS)再洗滌1次，重懸，計數(shù)，并用臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞活力大于95%。

前期試驗已檢測染毒48 h時，ZEA的半抑制濃度(IC50)為(23.91±4.96) μg/mL。通過IC50篩選出ZEA的作用濃度為對照組0、Z1組0.10 μg/mL、Z2組0.40 μg/mL、Z3組1.60 μg/mL、Z4組6.25 μg/mL和Z5組25.00 μg/mL[8]。

1.2.2 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率和壞死率

染毒培養(yǎng)48 h時，收集細(xì)胞，1 500 r/min離心3 min，用PBS洗滌細(xì)胞3次。離心后，加500 μL Binding Buffer制備細(xì)胞懸液，再加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光反應(yīng)5～15 min，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞壞死率，同時以不加Annexin V-FITC及PI作為試劑對照。激發(fā)波長為488 nm，Annexin V-FITC的綠色熒光通過異硫氰酸熒光素(FITC)通道(FL-1，530 nm)檢測，PI的紅色熒光通過PI通道(FL-2，585 nm)檢測。每個樣品以10 000個細(xì)胞計數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)由流式細(xì)胞儀的標(biāo)準(zhǔn)計算機程序分析獲得。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量的測定

染毒培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，1 500 r/min離心3 min，后用PBS洗滌細(xì)胞3次。選用對細(xì)胞內(nèi)過氧化氫(H2O2)特異性結(jié)合的熒光染料DCFH-DA對細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行檢測，用PBS懸浮細(xì)胞，加入DCFH-DA染液使其終濃度為100 μmol/L，混勻，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌3次，在流式細(xì)胞儀測定其平均熒光強度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)。

1.2.4 細(xì)胞線粒體膜電位的測定

染毒培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，1 500 r/min離心3 min，后用PBS洗滌細(xì)胞2～3次。選用對線粒體特異性結(jié)合的熒光染料羅丹明123對線粒體膜電位進(jìn)行檢測，用PBS懸浮細(xì)胞，加入羅丹明123染液使其終濃度為5 μg/mL，混勻，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌3次，在流式細(xì)胞儀測定其平均熒光強度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)。

1.2.5 上清液中Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3含量測定(ELISA法)

染毒培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心20 min，吸取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?，按ELISA試劑盒說明書測定上清液中Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3的含量。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控基因Bc1-2、p53、Bax、Bak-1及caspase-3的mRNA表達(dá)測定

按RNA提取試劑盒說明書操作，最終獲得組織總RNA；取組織總RNA適量，按PrimeScript RT-PCR Kit說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將提取的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，cDNA保存于-80 ℃?zhèn)溆没蛄⒓从糜赑CR。根據(jù)GenBank中發(fā)表的雞的β-肌動蛋白(β-actin)、Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3的全基因序列，應(yīng)用Prime 5.0軟件設(shè)計特異的上、下游引物，并經(jīng)GenBank Blast進(jìn)行同源性檢索后由Invitrogen公司(上海)合成。引物序列及參數(shù)見表1。

表1 引物序列及參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameters

相關(guān)基因cDNA的PCR反應(yīng)體系包括cDNA、上游與下游引物、高保真酶、Premix和ddH2O，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，按95 ℃ 變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)，4 ℃終止反應(yīng)；取PCR擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳2 h，凝膠成像儀拍照記錄PCR結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用REST軟件(Pfaffl)分析毒素處理樣品各目的基因mRNA的表達(dá)豐度，應(yīng)用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性F檢驗及相關(guān)性分析；其中上述各項指標(biāo)的測定重復(fù)3個不同批次的細(xì)胞，每批細(xì)胞每個樣本重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率和壞死率的影響

ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率和壞死率的影響見表2。ZEA染毒時，細(xì)胞凋亡率各組間差異顯著(P<0.05)。細(xì)胞壞死率除Z2組和Z3組差異不顯著(P>0.05)外，其余各組間差異均極顯著(P<0.01)。當(dāng)ZEA濃度達(dá)到6.25 μg/mL以上，細(xì)胞凋亡和壞死均有所減緩。

除Z5組較Z4組淋巴細(xì)胞的凋亡率和壞死率均有所下降外，其余試驗組的細(xì)胞凋亡率和壞死率均隨ZEA濃度的升高而升高，各ZEA組細(xì)胞凋亡率和壞死率均極顯著高于對照組(P<0.01)；且同濃度下，脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡率均高于壞死率，表明ZEA染毒主要導(dǎo)致脾臟淋巴細(xì)胞凋亡。

2.2 ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS含量與線粒體膜電位的影響

ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS含量與線粒體膜電位的影響見表3。ZEA染毒48 h，雞脾臟淋巴細(xì)胞ROS含量隨毒素濃度的升高而增加，各ZEA組ROS含量極顯著高于對照組(P<0.01)；而線粒體膜電位隨毒素濃度的升高而降低(Z3組除外)，各ZEA組線粒體膜電位極顯著低于對照組(P<0.01)。ROS含量除Z3組與Z4組間差異不顯著(P>0.05)外，其余各組間差異顯著(P<0.05)；ZEA組間線粒體膜電位差異顯著(P<0.05)。

表2 ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率和壞死率的影響Table 2 Effects of ZEA on the apoptotic rate and necrotic rate of chicken splenic lymphocytes %

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。
In the same column, values with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS含量與線粒體膜電位的影響Table 3 Effects of ZEA on intracellular ROS content and mitochondrial membrane potential in chicken splenic lymphocytes

2.3 ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3含量的影響

ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3含量的影響見表4。針對Bcl-2含量，除Z1組與Z2組間差異不顯著(P>0.05)外，其余各組間差異均極顯著(P<0.01)；針對p53含量，各組間均差異顯著(P<0.05)；針對Bax含量，Z1組、Z2組、Z3組和對照組之間差異均不顯著(P>0.05)，Z4組和Z5組之間及與上述各組間差異極顯著(P<0.01)；針對Bak-1含量，各組間差異均顯著(P<0.05)；針對caspase-3含量，除Z3組和Z4組間差異不顯著(P>0.05)外，其余各組間均差異顯著(P<0.05)。

由此表明，p53、Bax、Bak-1和caspase-3含量隨毒素濃度的升高而增加，Bcl-2含量隨毒素濃度的升高而降低，具有顯著的劑量依賴關(guān)系。

2.4 ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3 mRNA表達(dá)的影響見表5。針對Bcl-2 mRNA表達(dá)量，Z1組、Z2組和Z3組間Bax/Bcl-2值差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于對照組(P<0.05)，Z4組和Z5組極顯著高于其他各組(P<0.01)；針對p53 mRNA表達(dá)量，各ZEA組極顯著高于對照組(P<0.01)；針對BaxmRNA表達(dá)量，各組間差異顯著(P<0.05)；針對Bak-1 mRNA表達(dá)量，除Z2組和Z3組間差異不顯著(P>0.05)外，其余各組間差異極顯著(P<0.01)；針對caspase-3 mRNA表達(dá)量，對照組、Z1組、Z2組和Z3組間差異不顯著(P>0.05)，Z4組和Z5組極顯著高于其他各組(P<0.01)，且2組間差異極顯著(P<0.01)。

由此表明，除caspase-3 mRNA表達(dá)量在Z1組、Z2組和Z3組略小于對照組外，Bax/Bcl-2值以及Bax、Bak-1和caspase-3的mRNA表達(dá)量隨毒素濃度的升高而增加，具有顯著的劑量依賴關(guān)系。

表4 ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3含量的影響Table 4 Effects of ZEA on contents of Bc1-2, p53, Bax, Bak-1 and caspase-3 in supernatants of chicken splenic lymphocytes

表5 ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3 mRNA表達(dá)的影響Table 5 Effects of ZEA on mRNA expression of Bc1-2, p53, Bax, Bak-1 and caspase-3 in chicken splenic lymphocytes

3 討 論

本實驗室前期研究表明，ZEA在體內(nèi)試驗中可以誘導(dǎo)小鼠腎臟細(xì)胞、腦細(xì)胞和肝臟細(xì)胞的凋亡[8-11]，在體外試驗中可以誘導(dǎo)豬脾臟淋巴細(xì)胞凋亡[12]。在本試驗中，ZEA可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞凋亡，結(jié)果和前期試驗結(jié)果一致。

線粒體在氧化代謝過程中產(chǎn)生大量ROS。在自由基產(chǎn)生過多或抗氧化防御系統(tǒng)作用減弱時，機體不能有效清除線粒體內(nèi)ROS，造成蓄積，過量蓄積的ROS可氧化線粒體滲透性轉(zhuǎn)運孔上的相應(yīng)氧化還原敏感位點，導(dǎo)致線粒體膜電位降低、線粒體腫脹和進(jìn)一步產(chǎn)生ROS，進(jìn)而造成線粒體的氧化損傷[13]。本研究結(jié)果表明ZEA染毒使雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS大量積累，線粒體膜電位極顯著下降，和上述研究一致。

細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)途徑是經(jīng)過特殊的死亡信號激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶系統(tǒng)來實現(xiàn)的[14]。caspase-3是在多種誘導(dǎo)劑刺激后導(dǎo)致凋亡的關(guān)鍵酶，它的活化預(yù)示著細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的開始。正常情況下，它以酶原形式存在于胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時，它被系列反應(yīng)激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[15-17]。ZEA可誘導(dǎo)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶凋亡通路[18]。本研究結(jié)果顯示，ZEA能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞caspase-3的mRNA表達(dá)量增加，分泌在上清液中的caspase-3蛋白也增加，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，和上述試驗結(jié)果一致。

在細(xì)胞凋亡過程中，p53蛋白起著至關(guān)重要的作用。p53蛋白主要集中于核仁區(qū)，能與DNA特異結(jié)合，具有明顯的細(xì)胞轉(zhuǎn)化抑制作用，對保護(hù)細(xì)胞基因組DNA的完整性具有重要作用。如果DNA受到外來損傷，p53可作為轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)一系列下游基因的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞停止在G期，使DNA有足夠的時間得到修復(fù)。如果DNA損傷嚴(yán)重，修復(fù)失敗、并且不可逆則p53啟動凋亡程序誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。Ayed Boussema等[20]研究ZEA對人的肝細(xì)胞是激活p53，通過p53途徑以劑量依賴方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Yu等[6]研究ZEA對RAW264.7巨噬細(xì)胞的毒性作用，其中p53的激活起到了關(guān)鍵作用。Bouaziz等[21]研究ZEA對人的肝癌細(xì)胞的毒性，得出ZEA引發(fā)p53依賴的凋亡通路致細(xì)胞凋亡的分子機制。本試驗結(jié)果也表明ZEA從基因水平改變了雞脾臟淋巴細(xì)胞p53的表達(dá)，干擾了p53凋亡通路的調(diào)控，從而誘發(fā)雞脾臟淋巴細(xì)胞凋亡。

Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)通過線粒體使細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，Bcl-2蛋白主要分布于線粒體膜、核膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，參與維持線粒體膜的完整性，防止細(xì)胞色素C的釋放，阻止凋亡的“內(nèi)源性激活”，是細(xì)胞的抗凋亡成員[22]。當(dāng)Bax形成同源二聚體Bax-Bax時，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，隨著Bcl-2表達(dá)量的上升，越來越多的Bax二聚體分開，與Bcl-2形成比Bax-Bax二聚體更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2的異二聚體，從而中和了Bax-Bax二聚體調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用，即細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2的值對于決定細(xì)胞接受刺激信號后存活與否起關(guān)鍵作用。Bcl-2過量表達(dá)細(xì)胞存活，Bax過量表達(dá)則細(xì)胞凋亡[23]。Yuan等[24]研究得出ZEA誘導(dǎo)小鼠雄性生殖細(xì)胞的凋亡基因Bax的mRNA的表達(dá)增加，Bcl-2的mRNA表達(dá)減少。Yu等[25]研究ZEA對人的乳腺癌MCF-7細(xì)胞的研究，發(fā)現(xiàn)ZEA顯著抑制細(xì)胞凋亡，存在劑量依賴性，Western blot和多重RT-PCR分析顯示，抗凋亡的Bcl-2蛋白和mRNA水平上調(diào)，促凋亡的Bax下調(diào)，說明ZEA具有雌激素活性，并能促進(jìn)MCF-7細(xì)胞通過細(xì)胞周期由G0/G1期減少和S期的顯著增加的進(jìn)展，通過Bcl-2表達(dá)調(diào)控抑制細(xì)胞凋亡。本試驗結(jié)果顯示，在ZEA對雞脾臟淋巴細(xì)胞作用下，Bak-1的表達(dá)均有所升高，Bax/Bcl-2值也增加，其蛋白含量也隨之增加或減少。

4 結(jié) 論

① 本試驗表明，隨ZEA濃度升高，細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白p53、Bax、Bak-1和caspase-3的含量升高，Bcl-2含量卻下降；ZEA上調(diào)Bcl-2家族基因(Bax和Bak-1)、p53基因和caspase-3基因表達(dá)，抑制Bcl-2家族基因中Bcl-2基因表達(dá)。

② ZEA通過激活p53和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶通路而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，并且凋亡是由氧化應(yīng)激引起。