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(1 .北京市獸藥監(jiān)察所，北京 102600；2.首都師范大學(xué)化學(xué)系，北京 100048)

烯丙孕素是一種人工合成的甾類促孕激素[1，2]，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。烯丙孕素可抑制促性腺激素的釋放[3]，降低其在血漿中的濃度發(fā)揮藥理活性，畜牧業(yè)中常用烯丙孕素使動物同步發(fā)情進行繁育[4-6]。長期食用含有烯丙孕素藥物的肉制品會影響機體內(nèi)激素平衡，誘發(fā)癌變，導(dǎo)致幼兒發(fā)育異常等[7]。目前很多國家已對食物中烯丙孕素殘留限量做出嚴(yán)格的規(guī)定和要求[8]，如日本規(guī)定鰻魚中烯丙孕素的最高殘留限量為3.0μg/kg，歐盟嚴(yán)格限制乙酰孕激素在動物生長中的使用。我國尚未批準(zhǔn)該藥用于獸醫(yī)臨床。

圖1 烯丙孕素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

國外報道有關(guān)烯丙孕素殘留的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[9]、液相色譜法[10]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-14]等。酶聯(lián)免疫法具有較高靈敏度，但易出現(xiàn)假陽性；液相色譜法抗干擾能力差且靈敏度低，易受基質(zhì)中結(jié)構(gòu)相似化合物的干擾；氣相色譜法樣品衍生化前處理繁瑣等。國內(nèi)關(guān)于烯丙孕素殘留檢測的報道很少，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有快速，靈敏度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點，將是未來烯丙孕素殘留檢測的發(fā)展方向。

本實驗建立了豬肌肉組織中烯丙孕素殘留檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，滿足國內(nèi)外法規(guī)中關(guān)于烯丙孕素殘留定性定量分析。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；電子分析天平(北京賽多利斯有限公司)；高速冷凍離心機(日本HITACHI 公司)；氮吹儀(Organomation Associates 公司)；旋渦混合儀(德國IKA公司)。

1.1.2試劑

烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr公司，純度≥99.0%；乙腈、甲醇，色譜純，甲酸，質(zhì)譜級，均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；乙酸乙酯，分析純，購自北京化工試劑廠。其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品前處理

取豬肌肉組織樣本2g±0.01g于50mL離心管中，12000r/min高速勻漿2min，加入5mL乙腈+乙酸乙酯(V/V,3∶2)提取液，渦旋混勻5min，離心10min(4℃，10000r/min)，5mL提取液重復(fù)提取1次，將兩次提取上清液合并于15mL離心管中，置于-20℃冰箱，冷凍30min，快速轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心機，離心5min(4℃，10000r/min)，棄去脂肪層，轉(zhuǎn)移溶液至15mL離心管，40℃水浴氮吹至干，殘余物用1mL20%乙腈水溶液復(fù)溶，上清液過0.22μm濾膜，供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.2液相色譜參考條件

液相色譜條件：C18柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；流動相A：乙腈，流動相B：0.1%甲酸水；流速：0.3mL/min，梯度洗脫參數(shù)見表1；進樣量：5μL；柱溫：室溫。

表1 烯丙孕素超高效液相色譜梯度洗脫條件

1.2.3 質(zhì)譜參考條件

離子源：電噴霧(ESI)離子源；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；掃描方式：正離子掃描；電離電壓：3.0 kV；源溫：150℃；霧化溫度：450℃；錐孔氣流速：150 L/h；霧化氣流速：800 L/h。質(zhì)譜參考條件見表2。

表2 烯丙孕素定性定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量

1.2.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取適量烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在空白基質(zhì)中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)工作液配制成5個不同濃度(1、5、10、25、50 ng/mL)，以濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化

烯丙孕素常用提取試劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑?？紤]到提取過程中雜質(zhì)干擾和回收率測定，本實驗選用乙酸乙酯和乙腈作為提取液提取效果較優(yōu)。

樣品中雜質(zhì)主要為蛋白質(zhì)、脂類及極性小分子成分，蛋白質(zhì)和極性小分子可通過有機試劑去除[15]。脂類對檢測響應(yīng)有較大干擾作用，常用去脂方法有加入正己烷萃取或采用冷凍脫脂，采用正己烷脫脂會導(dǎo)致提取液乙腈層的部分損失, 從而影響結(jié)果準(zhǔn)確性。相關(guān)研究指出[16]，采用低溫冷凍方法去除脂類其效果可滿足檢測要求。

2.2 色譜條件優(yōu)化

采用C18反相色譜柱可使烯丙孕素藥物較好分離，本研究結(jié)果表明柱長50 mm，柱內(nèi)徑2.1 mm, 粒度1.7 μm，C18反相色譜柱對烯丙孕素分離效果最好。以乙腈-0.1%甲酸水作為流動相梯度洗脫，進樣量5 μL，流速0.3 mL/min。結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水做流動相對烯丙孕素有良好的色譜分離效果，可兼顧質(zhì)譜響應(yīng)，色譜峰峰形較優(yōu)。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

不同藥物對流動相、流速、色譜柱等的響應(yīng)和靈敏度不同，甚至?xí)霈F(xiàn)離子抑制或者增強效應(yīng)，需考慮所測藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)，以達到滿意的效果。在正離子檢測方式下，選取豐度較強、干擾較小的兩對子離子為定性離子，對各參數(shù)進行優(yōu)化，烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)品(MRM)色譜圖如圖2。

圖2 烯丙孕素標(biāo)準(zhǔn)品(MRM)色譜圖(4.0 ng/mL)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍

在選擇色譜條件下，添加適量標(biāo)準(zhǔn)工作液配制濃度1、5、10、25、50 ng/mL基質(zhì)匹配溶液，烯丙孕素在豬肌肉基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

結(jié)果表明，在1～50 ng/mL濃度范圍內(nèi)烯丙孕素色譜峰面積與濃度呈良好線性相關(guān)，回歸方程：Y= 29146X+47967，相關(guān)系數(shù)R2為0.9969。

圖3 烯丙孕素在豬肌肉基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 檢測方法靈敏度

方法檢測限(LOD)和定量限(LOQ)：按照藥物選擇離子響應(yīng)色譜峰信噪比S/N>3(按PtP算)確定檢測限；按照藥物選擇離子響應(yīng)色譜峰的信噪比S/N>10(按PtP算)確定定量限。

添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 g空白試樣中，分別制備得到0.3 μg/kg和1.0 μg/kg的添加樣品，按檢測步驟處理樣品、檢測。結(jié)果表明，烯丙孕素檢測限(LOD)為0.3 μg/kg，定量限(LOQ)為1.0 μg/kg。

2.4.3 檢測方法準(zhǔn)確度和精密度

選取空白樣品進行空白添加實驗，驗證該方法的準(zhǔn)確度和精密度，豬肌肉組織添加和空白中烯丙孕素MRM色譜圖見圖4和圖5。添加濃度為1.0、2.0、10.0 μg/kg，每個濃度設(shè)5個平行，連續(xù)做3天，計算添加回收率、日內(nèi)變異系數(shù)和日間變異系數(shù)。在3個濃度添加水平下，平均回收率范圍為68.5%～87.9%；日內(nèi)變異系數(shù)1.1%～6.0%，日間變異系數(shù)5.5 %～10.7%，方法回收率及精密度滿足殘留檢測要求，檢測方法準(zhǔn)確度及精密度結(jié)果見表3。

表3 豬肌肉組織中烯丙孕素添加回收率和變異系數(shù)(n=5)

圖4 空白豬肌肉組織烯丙孕素MRM色譜圖

圖5 烯丙孕素豬肌肉組織添加MRM色譜圖(2.0 μg/kg)

3 結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了豬肌肉組織中烯丙孕素殘留的快速檢測方法，對提取試劑、液相色譜、質(zhì)譜條件等進行了優(yōu)化，并進行了方法學(xué)考察。結(jié)果表明，該方法快速、簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，回收率滿足殘留檢測要求；適用豬肌肉組織中烯丙孕素殘留檢測的要求。