隋曉丹

（長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院肝脾胃病科，吉林 長春 130021）

本實驗通過觀察肝脂溶顆粒對NAFLD模型大鼠肝臟組織TNF-α表達的影響，及肝臟組織TNF-α表達在非酒精性脂肪肝中的作用并探明調節(jié)其作用的傳導途徑，為中醫(yī)臨床干預治療非酒精性脂肪肝提供理論依據(jù)和新的思路。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 Wistar大鼠60只，雄性，體質量（200±20） g。

1.2 藥物 肝脂溶顆粒：長春中醫(yī)學院附屬醫(yī)院制劑室，批準文號：長衛(wèi)制藥字 (96)1367號。多烯磷脂酰膽堿膠囊：賽諾非安萬特（北京）制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20059010。

2 實驗方法

2.1 非酒精性脂肪肝模型復制方法 大鼠適應環(huán)境1周后隨機分為正常組9只、高脂組51只。正常組予普通飼料喂養(yǎng)，高脂組予高脂飼料（88%基礎飼料、10%豬油、2%膽固醇）喂養(yǎng)，自由飲水。12周后隨機選出7只大鼠（正常組1只，高脂組6只），處死后取肝臟組織進行HE染色，驗證造模情況。

2.2 實驗動物分組及給藥方法 12周后，正常組大鼠普通飼料喂養(yǎng)同時每日生理鹽水灌胃。高脂組大鼠隨機分為模型組、多烯磷脂酰膽堿膠囊對照組（簡稱：對照組）、肝脂溶顆粒高、中、低劑量組（簡稱：高、中、低劑量組）。繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)同時每日給予不同藥物進行灌胃（模型組：生理鹽水灌胃1 mL/100 g；對照組：多烯磷脂酰膽堿膠囊水溶液灌胃，按0.14 g/kg體重給藥；高劑量組：100%濃度肝脂溶顆粒水溶液灌胃，按3 g/kg體重給藥；中劑量組：70%濃度肝脂溶顆粒水溶液灌胃，按2.1 g/kg體重給藥；低劑量組：30%濃度肝脂溶顆粒水溶液灌胃，按0.9 g/kg體重給藥）。連續(xù)灌胃4周后取材。

2.3 肝臟組織標本采集 腹主動脈取血處死大鼠，打開腹腔完整分離肝臟，快速取下肝臟組織一部分置于10%中性緩沖福爾馬林溶液中（PH 7.4）固定，常規(guī)脫水后，石蠟包埋備用。

2.4 觀察指標 免疫組化法檢測肝臟組織TNF-α的表達。

2.4.1 免疫組織化學染色方法 石蠟切片常規(guī)脫蠟進水；熱修復抗原；染色。

2.4.2 表達結果判定 在光鏡下觀察切片，根據(jù)免疫組化染色強度進行半定量判定。表達細胞的胞漿中可見棕黃色顆粒為陽性結果的判定標準，顏色越深，表示表達越強。如細胞胞漿中未出現(xiàn)棕黃色顆粒則為陰性結果。

TNF-α計分標準，按染色區(qū)變化和染色強度分為0～4分：0分：無染色或染色極弱。1分：局部弱染、染色區(qū)＜25%。2分：局部染色稍強、染色區(qū)25%～50%。3分：肝竇周圍和匯管區(qū)染色增強，染色區(qū)50%～75%。4分：肝竇周圍和匯管區(qū)染色呈強染，染色區(qū)＞75%。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標準差（±s）表示。

3 實驗結果

正常組肝組織內偶見少量淡黃色顆粒，TNF-α蛋白表達極弱；模型組肝臟組織內可見明顯增多的棕黃色顆粒，主要以匯管區(qū)和肝竇周圍最為顯著；其它藥物干預組肝臟組織內棕黃色顆粒與模型組相比明顯減少，表達強度也減弱，藥物組中高劑量組肝臟組織內棕黃色顆粒相對較少，表達強度較弱；中劑量組與對照組相似，肝臟組織內棕黃色顆粒數(shù)量級表達強度均高于高劑量組；低劑量組肝臟組織內可見廣泛黃色顆粒，表達強于其它藥物干預組。

半定量評分結果示：各NAFLD模型組大鼠肝臟組織內TNF-α的表達明顯高于正常組（P<0.01），差異具有統(tǒng)計學意義；模型組大鼠肝臟組織內TNF-α的表達明顯高于各藥物干預組（P<0.01），差異具有統(tǒng)計學意義；高劑量組大鼠肝臟組織內TNF-α的表達低于對照組（P<0.05），差異具有統(tǒng)計學意義；中劑量組大鼠肝臟組織內TNF-α的表達與對照組比較（P>0.05），差異無統(tǒng)計學意義；低劑量組大鼠肝臟組織內TNF-α的表達高于高、中劑量組及對照組（P<0.05），差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 各組大鼠16周末肝臟組織TNF-α蛋白表達比較

圖1 大鼠肝臟組織TNF-α表達免疫組化染色 （×200）

4 討論

TNF-α是機體炎癥反應和免疫應答反應的主要調節(jié)因子，TNF-α作為炎性細胞因子[1]可以通過增加氧自由基的產生和脂質過氧化[2]等方面引起脂肪性肝炎[3]和脂肪性纖維化。TNF-α還是NAFLD發(fā)病過程中胰島素抵抗的一個關鍵性介質[4]，在脂肪組織中TNF-α水平與胰島素抵抗呈正相關[5]，TNF-α主要通過干擾胰島素信號轉導、抑制葡萄糖轉運、減少PPARγ的合成及調節(jié)FFA[6]參與介導肝臟及外周組織的胰島素抵抗，還能夠直接或間接損傷β細胞，導致胰島素分泌缺陷。

劉鐵軍教授總結多年治療非酒精性脂肪肝的臨床經驗，針對濕熱瘀積證自研肝脂溶顆粒[7]，由決明子、枳椇子、澤瀉等組成，諸藥合用，共奏清熱利濕、化瘀消積之功效。

實驗結果表明肝脂溶顆粒能夠顯著降低大鼠肝臟組織TNF-α表達，進而減輕TNF-α對胰島素信號傳導的影響和其細胞因子的毒性作用，達到治療NAFLD的目的。其療效與劑量呈正相關，且對降低大鼠肝臟組織TNF-α表達療效優(yōu)于多烯磷脂酰膽堿膠囊。高脂飲食誘導致NAFLD大鼠肝臟組織TNF-α表達明顯增高，這可能是大鼠引起非酒精性脂肪肝的機制之一，肝脂溶顆粒顯著降低了肝臟組織TNF-α表達，因此，肝脂溶顆粒對非酒精性脂肪肝的防治作用可能是通過降低肝臟組織TNF-α表達而完成的。