趙婧文 張建逵 魏 巍 李曉晨 李 麗 牛 蕾

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 ，遼寧 大連 116600）

粉葛為豆科植物甘葛藤（Pueraria thomsonii Benth）的干燥根，具有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽(yáng)止瀉，通經(jīng)活絡(luò)，解酒毒等功效[1]。粉葛淀粉含量較高，粉性較強(qiáng)，其主要藥用成分為葛根素；傳統(tǒng)鑒定經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為粉葛“凡粉性足者為佳”，而在市場(chǎng)上銷售的大多為栽培藥材，淀粉含量較高，此結(jié)論是否依然成立？本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法與HPLC法分別測(cè)定淀粉含量與葛根素含量，探討兩者之間的相關(guān)性，為粉葛栽培藥材提供質(zhì)量控制依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 UV-3010紫外可見雙光束掃描分光光度計(jì)（日本日立集團(tuán)）；BP 211D型電子分析天平 (德國(guó)賽多利斯公司)；水浴鍋（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），包括G1314A型VWD檢測(cè)器，G1311A型四元泵。AT-130型柱溫箱（大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司），KQ-250型超聲清洗器 (昆山超聲儀器有限公司)，F(xiàn)W100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），TD6001C型電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司)。

1.2 試劑與試藥 甲醇色譜純（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醇分析純（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；其它試劑均為分析純。無(wú)水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；高氯酸（天津市西青鑫源化工廠）；蒽酮（上海源葉生物科技有限公司）；濃硫酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；可溶性淀粉（Solarbio科技有限公司）；葛根素（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：YM0510YA14）

1.3 樣品 在2017年9月，從不同藥店購(gòu)進(jìn)10批不同產(chǎn)地的粉葛飲片，所有樣品均為生飲片，未經(jīng)炮制。均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張建逵副教授鑒定粉葛為豆科植物甘葛藤（Pueraria thomsonii Benth） 的干燥根。具體來(lái)源見表1。

表1 粉葛飲片樣品來(lái)源

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 粉葛淀粉含量測(cè)定

2.1.1 試液的配制 2%蒽酮試劑：精密稱取1 g蒽酮，加入50 mL乙酸乙酯，超聲使全部溶解，4℃避光保存?zhèn)溆谩?0%乙醇；9.2 mol/L高氯酸[2]。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱量0.01 g樣品粉末于15 mL離心管中，加入80%乙醇溶液8 mL，80℃水浴30 min，靜置或離心，沉淀后棄上清液，此步驟重復(fù)3次，后2次分別水浴10 min，殘留物加入6 mL的9.2 mol/L高氯酸，快速振蕩搖勻，反應(yīng)5 min，靜置或離心，沉淀后上清液移入100 mL容量瓶中，重復(fù)3次，用6 mL蒸餾水洗滌殘?jiān)?次，清洗液移入容量瓶中，蒸餾水定容，搖勻，即得。

2.1.3 樣品測(cè)定 精密量取1 mL供試品溶液于15 mL離心管中，蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，空白對(duì)照試管中只加入2 mL蒸餾水。每只試管中加入0.5 mL 2%蒽酮試劑，并緩慢加入5 mL 98%的濃硫酸，迅速搖勻，于沸水浴中準(zhǔn)確計(jì)時(shí)1 min顯色，取出迅速置于冰水浴中冷卻5 min，取出后室溫放置5 min，于630 nm處測(cè)定吸光度值。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取0.05 g淀粉于小燒杯中，加入18 mL 9.2 mol/L高氯酸，完全溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，蒸餾水沖洗，移入容量瓶，定容，即為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待用。分別量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于15ml離心管中，用蒸餾水補(bǔ)充至2 mL，檢測(cè)方法同“2.1.3”項(xiàng)下的樣品測(cè)定方法，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=3821.8X+0.287，r=0.9993。結(jié)果表明，淀粉含量在0～0.25 mg/mL內(nèi)具良好的線性關(guān)系。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取S2樣品粉末0.01 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，顯色后在630 nm處測(cè)定吸光度，平行測(cè)量5次，結(jié)果見表2。測(cè)得粉葛淀粉的RSD值為0.36%，表明儀器重現(xiàn)性良好。

表2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果

2.1.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取S2樣品粉末0.01 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、25、30 min在630 nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果見表3。測(cè)得粉葛淀粉的RSD值為1.02%。表明此方法在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果

2.1.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取S2樣品粉末5份，每份0.01 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，顯色后在630 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果見表4。測(cè)得粉葛淀粉含量RSD值為2.4%，表明此方法重復(fù)性良好。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果 (%)

2.1.5.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取S2樣品粉末5份，每份10 mg（淀粉含量為38.7%），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，精密吸取1 mL供試品溶液（含淀粉0.0387 mg）于15 mL離心管中，并加入0.4 mL淀粉標(biāo)準(zhǔn)品溶液，蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，將混合液進(jìn)行顯色并測(cè)定吸光度，結(jié)果見表5。測(cè)得粉葛淀粉的平均回收率為103.1%，RSD值為1.6%[3]。

表5 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.2 葛根素含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 采用Waters symmetry-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇-水 （25∶75） 為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為25℃。在該色譜條件下，對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品溶液(A)和供試品溶液(B)的色譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取葛根素對(duì)照品適量，精密稱定，加30%乙醇制成每1 mL含80 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%的乙醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱定5 mg葛根素標(biāo)準(zhǔn)品，置于5 mL容量瓶中，用30%乙醇定容，即為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待用。分別量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于5 mL容量瓶中，用30%乙醇定容，按“2.2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=37925X-83.926，r=0.99990。結(jié)果表明葛根素含量在0～0.1 mg/mL內(nèi)具良好的線性關(guān)系[1]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 粉葛淀粉及葛根素含量測(cè)定結(jié)果 (%)

對(duì)表6中淀粉含量及葛根素含量進(jìn)行相關(guān)性分析，得到回歸方程為:Y=-0.002X+0.375 r=0.8019（P<0.05），因此，淀粉含量與葛根素含量呈負(fù)相關(guān)。

4 討論

按照2015版《中國(guó)藥典》的規(guī)定[1]，粉葛中葛根素含量不得少于0.30%，照此標(biāo)準(zhǔn)，上述10批藥材中僅有3批合格，合格率僅為30%，因此。相關(guān)部門對(duì)該藥材的質(zhì)量應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管。

經(jīng)相關(guān)性分析表明，粉葛淀粉含量與藥用成分呈負(fù)相關(guān)。粉葛藥材中，淀粉含量越多則有效成分越少，因此對(duì)于目前的粉葛藥材，“粉性足者為佳”這一經(jīng)驗(yàn)并不完全適用，本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明栽培藥材淀粉含量越高，其藥用成分含量就越低，兩者含量關(guān)系密切。這是因?yàn)樵耘嗨幉牡纳L(zhǎng)環(huán)境條件優(yōu)越，淀粉作為初生代謝產(chǎn)物積累就較多，而葛根素作為次生代謝產(chǎn)物含量就較低，因此，在中藥材栽培過(guò)程中，不能一味追求產(chǎn)量，還要考慮到人工栽培技術(shù)對(duì)藥材質(zhì)量的影響?？梢酝ㄟ^(guò)控制其淀粉生成量或消耗自身淀粉，如剪秧、逆境等環(huán)境加速淀粉消耗[4]，來(lái)提高栽培粉葛藥材中葛根素的含量。