孫乾，張愛琴，李芳，羅豐收，孔令明*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)2(新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830021)

菊科植物紅花是新疆特有的一種經(jīng)濟類作物，也是新疆民族特色藥，其花、籽、莖、葉均可使用[1]。目前開發(fā)的主要用于活血化瘀等疾病的治療[2]。紅花籽粕是紅花籽經(jīng)制油后的副產(chǎn)品，籽粕中具有能清除DPPH自由基活性的物質(zhì)和抗氧化性[3-5]，國內(nèi)外對紅花籽粕綜合利用的研究甚少。

紅花籽中含有紅色素、黑色素等多種天然色素[6-9]，這在提取紅花籽蛋白時會導(dǎo)致蛋白色澤較差。目前針對提取紅花籽粕蛋白的研究較少，且關(guān)于紅花籽粕蛋白顏色變化的機理性、程度性也尚不清楚[10-11]。脫色的目的是去除不必要的色素成分[12]。目前對于溶液類及其制品的脫色的方法較為常用的有：大孔樹脂吸附法[13]、有機溶劑萃取法[14-15]、活性炭吸附法和雙氧水氧化法[16-17]等。

雙氧水屬于強氧化劑，其脫色機理是：在水溶液中電解出相應(yīng)的過氧氫根離子(HOO-)使樣品中相應(yīng)的基團發(fā)生變化而脫色[18]。雙氧水脫色的總體效果較好，條件溫和，殘留雜質(zhì)較少；但其相對具有較強的腐蝕性。超聲波和微波作為輔助方法，常與雙氧水合用，既縮短脫色時間，又能起到良好的脫色效果[19-20]。

活性炭屬于表面吸附性物質(zhì)。從凡華等[21]利用活性炭對馬鈴薯渣進行脫色時發(fā)現(xiàn)，活性炭對馬鈴薯渣的脫色效果較好?；钚蕴烤哂袩o毒、無臭、反復(fù)利用以及成本較低等特點。

臭氧也屬于強氧化劑，是一種新型的、綠色的、環(huán)保的脫色方法，且在水溶液中易分解、無殘留，但對水不溶性物質(zhì)脫色較差[22]。此外，還有二氧化氯、次氯酸鹽等脫色劑[23-24]。

對紅花籽粕蛋白的脫色工藝進行研究，可提高其產(chǎn)品附加值，增加農(nóng)民的收入，減少環(huán)境的污染，把紅花籽精深加工提升一個空間，也使得紅花籽、紅花籽粕的綜合性利用具有深遠的產(chǎn)業(yè)和經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅花籽粕，新疆莊子實業(yè)有限公司；紅花籽粕蛋白提取液，實驗室自制；活性炭顆粒，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；H2O2，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白，上海江萊生物科技有限公司；考馬斯亮藍，美國BIOSHARP公司；NaOH、HCl，均為分析純，山東海化股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，梅特勒-托利多儀器,上海有限公司；TDL-5-A低速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；雷磁pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DZKW-S-6數(shù)顯式恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；TU-1810PC紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；NH310高品質(zhì)便攜式電腦色差儀，深圳市三恩馳科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 測定蛋白質(zhì)的等電點

取紅花籽粕蛋白提取液50 mL，用稀鹽酸調(diào)節(jié)不同的pH值為：5.0、4.5、4.0、3.5和3.0，常溫下靜放一段時間，4 500 r/min，20 min離心，取離心后的上清液在紫外分光光度計下測定其蛋白含量，每一組做3個平行試驗。以蛋白質(zhì)在上清液中的殘留量為指標，得出紅花籽粕蛋白的最佳等電點(沉降點)。

1.3.2 活性炭的前處理

將活性炭顆粒融入1 mol/L的鹽酸溶液中浸泡1 h，過濾后用溫?zé)嵴麴s水進行沖洗，沖洗3～5次后放入鼓風(fēng)干燥箱中105 ℃烘干備用。

1.4 紅花籽粕蛋白提取液在活性炭作用下的脫色效果

準確量取蛋白提取液50 mL(制備方法同1.3.1)，加入不同含量的活性炭以及不同吸附時間的攪拌處理，4 500 r/min，10 min的離心，用考馬斯亮藍法測定蛋白的含量，并相應(yīng)分析蛋白的損失率。用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使之達到紅花籽粕蛋白的等電沉降點。4 500 r/min，20 min離心，取酸沉物質(zhì)，利用色差儀對蛋白的脫色效果進行測定。

按照以下公式進行計算：

(1)

式中：m，脫色后樣液中減少的蛋白質(zhì)的含量；M，脫色前樣液中的蛋白質(zhì)含量。

1.5 紅花籽粕蛋白提取液在雙氧水作用下的脫色效果

準確量取蛋白提取液50 mL(制備方法同1.3.1)，在不同含量的雙氧水、不同的脫色溫度、不同的吸附時間指標下，邊攪拌邊觀察脫色效果，4 500 r/min，10 min離心。用考馬斯亮藍法測定蛋白的含量，并相應(yīng)分析蛋白的損失率。用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使之達到紅花籽粕蛋白的等電沉降點。再次4 500 r/min，20 min離心，取酸沉物質(zhì)，利用色差儀對蛋白的脫色效果進行測定。

1.6 脫色工藝的優(yōu)化

對紅花籽粕蛋白的色素脫除分別用活性炭吸附和雙氧水漂洗2種方法，將試驗的結(jié)論與空白對照樣本進行多重比較，進行差異性評比分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定紅花籽粕蛋白的等電點

由圖1曲線趨勢可以得出，在一定指標范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，曲線呈現(xiàn)出先急劇下降后快速上升。由此可以說明，蛋白質(zhì)對酸性較為敏感，當(dāng)pH值降低到3.0左右時，籽粕中的酸性蛋白解離性加速；在pH值為3.5～4.5時，紅花籽粕蛋白達到沉淀時的平衡狀態(tài)；當(dāng)pH大于5.0時，紅花籽粕蛋白的溶解度劇增，因此選取pH 4.0作為紅花籽粕蛋白的最佳等電點。

圖1 紅花籽粕蛋白最佳等電點Fig.1 The best isoelectric point of sunflower seed meal protein

2.2 紅花籽粕蛋白提取液在活性炭中脫色分析

2.2.1 活性炭添加量對脫色率的影響[25]

準確量取蛋白提取液50 mL，加活性炭5%、10%、15%、20%、25%和30%并適度攪拌處理60 min，離心機4 500 r/min，10 min離心，用考馬斯亮藍法測定蛋白的含量，并相應(yīng)分析蛋白的損失率。用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使之達到紅花籽粕蛋白的等電點。室溫下靜放一段時間，4 500 r/min，20 min離心，取酸沉物質(zhì)。將所得酸沉物質(zhì)放于載玻片上，使用色差儀對其色亮反應(yīng)比色，其比色反應(yīng)見表1。

表1 活性炭添加量對蛋白損失率及脫色效果的影響Table 1 Effect of activated carbon on protein loss rateand decolorization

由表1數(shù)據(jù)可以得出，在一定指標范圍內(nèi)，隨著活性炭添加量的增大，脫色效果顯著。當(dāng)活性炭的添加程度達到20 g(樣液的1/5時)，添加量與脫色效果不再具有一定的相關(guān)性；若添加度達到25 g和30 g時，提取液中蛋白的損失便成倍增長，遠超過80%甚至近100%，且脫色效果不明顯。隨著紅花籽粕蛋白提取液脫色率的不斷升高，蛋白質(zhì)的損失率也相應(yīng)的成倍增長。因此，選擇20%的活性炭添加量。

2.2.2 脫色時間對脫色率的影響

準確量取蛋白提取液50 mL，加入含量20%的活性炭，選定15、30、45、60、75和90 min幾個脫色時間段。用考馬斯亮藍法測定蛋白的含量，并相應(yīng)分析蛋白的損失率。用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使之達到紅花籽粕蛋白的等電點。室溫下靜放一段時間，4 500 r/min，20 min的離心，取酸沉物質(zhì)。將所得酸沉物質(zhì)放于載玻片上，使用色差儀對其色亮反應(yīng)比色，其比色反應(yīng)見表2。

表2 活性炭脫色時間對蛋白損失率及脫色效果的影響Table 2 Effect of decolorization time of activated carbonon protein loss rate and decolorization

由表2數(shù)據(jù)可以得出，在75 min時，活性炭的脫色效果趨于平穩(wěn)，蛋白損失率亦達到平衡，不再有較明顯的損失。因此，選擇活性炭脫色時間為75 min。

2.3 紅花籽粕蛋白提取液在雙氧水中脫色分析

2.3.1 雙氧水添加量對脫色率的影響[26]

準確量取蛋白提取液50 mL，加雙氧水1%、2%、3%、4%和5%并適度攪拌處理60 min，離心機4 500 r/min，10 min離心，測定、分析蛋白含量及損失率。用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使之達到紅花籽粕蛋白的等電點。室溫下靜放一段時間，4 500 r/min，20 min離心，取酸沉物質(zhì)。將所得酸沉物質(zhì)放于載玻片上，使用色差儀對其色亮反應(yīng)比色，其比色反應(yīng)見表3。

表3 雙氧水添加量對脫色的影響Table 3 Effect of adding amount on decoloration

由表3數(shù)據(jù)可以得出，隨著雙氧水添加量從2%～5%，籽粕蛋白所呈現(xiàn)的明亮度也在平穩(wěn)中有所升高。當(dāng)添加4%的雙氧水時，蛋白由深色(墨綠)漸漸轉(zhuǎn)為淺色(偏紅色)；此時的蛋白損失率也呈現(xiàn)出緩慢增長的趨勢。當(dāng)繼續(xù)添加雙氧水時，紅花籽粕蛋白的顏色變化不再明顯，而此時蛋白的損失率突然增高。因此，選擇雙氧水添加量為4%(體積分數(shù))。

2.3.2 雙氧水溫度對脫色率的影響

準確量取蛋白提取液50 mL，加雙氧水稀釋液，在時間1 h范圍內(nèi)，選擇常溫(20 ℃)、30、40、50和60 ℃幾個溫度閾值。4 500 r/min，10 min離心，測定、分析蛋白含量及損失率。用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使之達到紅花籽粕蛋白的等電點。室溫下靜放一段時間，4 500 r/min，20 min離心，取酸沉物質(zhì)。將所得酸沉物質(zhì)放于載玻片上，使用色差儀對其色亮反應(yīng)比色，其比色反應(yīng)見表4。

表4 脫色溫度對脫色的影響Table 4 Effect of decoloration temperature on decoloration

由表4數(shù)據(jù)可以得出，在一定指標范圍內(nèi)，隨著脫色溫度從30～60 ℃，籽粕蛋白所呈現(xiàn)的明亮度也在平穩(wěn)中有所升高。當(dāng)溫度為50 ℃時，亮度有所下降，這可能由于溫度的升高使得雙氧水在一定程度上發(fā)生了一定的解離反應(yīng)，從而造成了雙氧水中有效的溶質(zhì)量較少，與此同時蛋白的損失也在大幅度增加；當(dāng)脫色溫度為60 ℃時，亮度雖在一定程度上有所提高，但此時會引起部分蛋白質(zhì)產(chǎn)生一定的變性，從而會一定程度上影響紅花籽粕蛋白的功能特性。因此，在既不讓蛋白變性受到更大的損失，又不浪費資源的情況下，選擇雙氧水脫色溫度為40 ℃。

2.3.3 脫色時間對脫色率的影響

準確量取蛋白提取液50 mL，加雙氧水稀釋液，在脫色溫度為40 ℃時，選定30、40、50、60和70 min幾個脫色時間段。離心機4 500 r/min，10 min離心，測定、分析蛋白含量及損失率。用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使之達到紅花籽粕蛋白的等電點。室溫下靜放一段時間，4 500 r/min，20 min的離心，取酸沉物質(zhì)。將所得酸沉物質(zhì)放于載玻片上，使用色差儀對其色亮反應(yīng)比色，其比色反應(yīng)見表5。

表5 脫色時間對脫色的影響Table 5 Influence of decoloration time on decoloration

由表5數(shù)據(jù)可以得出，在一定指標范圍內(nèi)，隨著脫除色素時間從30～70 min，籽粕蛋白所呈現(xiàn)的明亮度也在平穩(wěn)中有所升高。脫色時間在1 h時亮度達到最佳，繼續(xù)延長脫色時間，其脫色效果并不十分顯著，蛋白的損失一直呈現(xiàn)緩慢的增長趨勢，變化不明顯。因此，選擇雙氧水脫色時間為60 min。

2.4 紅花籽粕蛋白在不同處理方法時的對比分析

依照活性炭和雙氧水法可以得出紅花籽粕的最佳脫色條件，用此最佳條件，對紅花籽粕蛋白進行脫色，運用SPSS 18.0軟件的最小顯著差異法多重比較，其結(jié)果見表6。

表6 紅花籽粕蛋白在不同處理方法時的對比結(jié)果(LSD)Table 6 Comparison of sunflower seed meal protein indifferent treatment methods(LSD)

注：同一列的不同字母給出了差異性不同表示(p<0.05)。

由表6數(shù)據(jù)可以得出，紅花籽粕蛋白經(jīng)活性炭與雙氧水處理后的脫色效果顯著。

活性炭表面疏松多孔，對小分子類物質(zhì)有極強的吸附功能。由于是對紅花籽溶液進行吸附脫色，一些色素類會附在蛋白質(zhì)上，與蛋白質(zhì)相結(jié)合，對這種結(jié)合的分離比較困難且效果不明顯。因此在吸附色素的同時，也會吸附一定量的蛋白質(zhì)，從而造成蛋白質(zhì)的大量損失。雙氧水是一種常用的食品類漂白劑，具有極強的氧化性，能將有色物質(zhì)氧化成醛類或羧酸類物質(zhì)，而被氧化的醛、羧酸類物質(zhì)即可從吸附蛋白上脫離出來，這對蛋白質(zhì)的脫色有較為明顯的效果。

3 結(jié)論

通過試驗數(shù)據(jù)分析表明，紅花籽粕蛋白在pH 4.0時，能夠達到最佳的等電沉淀點。

對活性炭和雙氧水2種脫色效果以及蛋白質(zhì)損失率進行比對分析，2種脫除色素的方法對于脫色效果均表現(xiàn)明顯，但使用活性炭會在脫除色素時使31.65%的蛋白受到損失；而用雙氧水進行脫除色素時，由于雙氧水的漂白氧化作用，使得蛋白質(zhì)的損失比活性炭處理少，且被氧化的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醛、羧酸類物質(zhì)，極大地減少了殘留。

依據(jù)單因素試驗得出，雙氧水對紅花籽粕蛋白的脫色效果：a*0.46，b*10.08，L*60.5。最優(yōu)的脫除色素的工藝為：雙氧水添加量為4%(體積分數(shù))、溫度為50 ℃、脫色時間為60 min。