汪馬燕，李子杰，高曉冬

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122)

目前，肥胖、高血脂、高血壓和糖尿病等疾病的發(fā)病率迅速增加，主要原因是過度攝入高脂肪和高糖的食物。因此，低熱量的稀有糖(rare sugar)引起了廣泛關(guān)注。國際稀有糖協(xié)會(ISRS)對稀有糖的定義：自然界中存在但含量極低的一類單糖及其衍生物[1]。盡管稀有糖在自然界含量很少，卻在膳食、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域擁有重要地位，如低卡路里的木糖醇、甘露糖醇和赤蘚糖醇等在食品工業(yè)已得到廣泛應(yīng)用[2]。

根據(jù)稀有糖的定義，D-阿洛酮糖屬于一種稀有單糖[3]，在分類上，D-阿洛酮糖屬于己酮糖，是D-果糖三位碳所對應(yīng)的差向異構(gòu)體(圖1)。D-阿洛酮糖能夠作為一種零能量、不被消化的食用糖替代品[4-5]。商業(yè)碳水化合物和農(nóng)產(chǎn)品中D-阿洛酮糖含量相當(dāng)少，只有某些天然植物如鼠刺的提取物中含有少量D-阿洛酮糖[6]。由于D-阿洛酮糖具有零熱量，難以被腸道消化吸收等特性[7]，被美國食品導(dǎo)航網(wǎng)評價為最具潛力的蔗糖替代品，現(xiàn)多被引用為新型低卡路里甜味劑[8]。同時，D-阿洛酮糖也可以作為肝脂類酶和腸道α-糖苷酶的抑制劑，減少脂肪堆積[9]。SUNA等研究結(jié)果顯示D-阿洛酮糖通過抑制睪丸組織中ROS的產(chǎn)生，阻止鄰苯二甲酸二(2-乙基)乙酯誘導(dǎo)的睪丸損傷[10]。此外D-阿洛酮糖除了對6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有神經(jīng)保護(hù)的作用外，還能抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)下的單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1的表達(dá)[11]?；贒-阿洛酮糖諸多的生理功能，在未來食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用將會非常廣泛。美國的食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)于2002年已經(jīng)批準(zhǔn)D-阿洛酮糖為公認(rèn)安全食品(generally recognized as safe，GRAS)[3,5]，這為其工業(yè)化應(yīng)用提供了有力的保障。

圖1 D-果糖和D-阿洛酮糖的結(jié)構(gòu)式比較Fig.1 Structural comparison of D-fructose and D-psicose

D-阿洛酮糖功能活性與人類健康密切相關(guān)，建立完善的高產(chǎn)體系迫在眉睫。目前D-阿洛酮糖的研究瓶頸主要集中在如何擴大產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。早期D-阿洛酮糖的合成方法是化學(xué)轉(zhuǎn)化，其合成過程不僅繁瑣還存在一定的局限性，更不符合當(dāng)今綠色可持續(xù)發(fā)展的社會理念[12-13]。目前生產(chǎn)D-阿洛酮糖主要是利用酶固定轉(zhuǎn)化法，即對酶的克隆表達(dá)以及產(chǎn)物的分離精制[14]。不論是化學(xué)合成法還是生物轉(zhuǎn)化法制備D-阿洛酮糖，都存在一個大難題，產(chǎn)品分離與精制十分困難[6]。粗產(chǎn)品中的D-阿洛酮糖往往與其他糖混合在一起，不僅產(chǎn)率降低，而且D-阿洛酮糖與其混雜的糖理化性質(zhì)幾乎完全相同，所以很難精制與提純[13]。為了對當(dāng)前的D-阿洛酮糖合成體系進(jìn)行優(yōu)化，就必須解決這一難題。

在醛縮酶家族中，磷酸二羥基丙酮(dihydroxyacetone, phosphate,DHAP)依賴型醛縮酶是應(yīng)用最廣的一類醛縮酶。該類醛縮酶催化供體DHAP與受體醛的縮合反應(yīng)，生成的產(chǎn)物具有兩個新的立體中心，并且這兩個立體中心的構(gòu)型一般由醛縮酶來決定[15-16]。前期研究顯示，大腸桿菌MG1655來源的野生型L-鼠李樹膠糖-1-磷酸醛縮酶(L-rhamnulose-1-phosphate aldolase，RhaD)在以D-甘油醛作為醛受體時，失去了對該醛受體的立體選擇性，產(chǎn)生的D-阿洛酮糖與D-山梨糖比例約為1∶1，不利于D-阿洛酮糖的分離純化[17]。據(jù)報道,ANDREAS等人經(jīng)實驗得出大腸桿菌來源的Ⅱ型醛縮酶L-墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶(L-fuculose-1-phosphate aldolase，F(xiàn)ucA)的113位酪氨酸(Tyrosine，Tyr)是影響醛受體結(jié)合的一個重要位點[18-19]。RhaD與FucA同屬II型DHAP依賴型醛縮酶，我們推測其在催化機理上存在相似性。酶的組氨酸殘基從供體上攫取一個質(zhì)子得到烯醇負(fù)離子，該烯醇負(fù)離子對醛受體發(fā)起親核進(jìn)攻組氨酸和醛受體需要輔助金屬離子 Zn2+在活性位點配位(圖2-a)。

a-DHAP依賴II型醛縮酶催化機理圖;b-FucA與RhaD酶分子結(jié)構(gòu)圖圖2 FucA與RhaD酶分子結(jié)構(gòu)圖示以及催化機理Fig.2 Molecular structure and catalytic mechanism of FucA and RhaD

FucA的第92位、第94位、第155位3個組氨酸結(jié)合輔助的金屬離子，同時從底物分子上攝取質(zhì)子，這是一個可逆的過程。對比蛋白分子模型圖，我們知道RhaD的第141、143以及第212位3個組氨酸殘基行使類似的催化過程(圖2-b)?；诎被嵝蛄斜葘Πl(fā)現(xiàn)，RhaD和FucA在酪氨酸位點上具有保守性：FucA的113位酪氨酸對應(yīng)RhaD的152位酪氨酸。本研究通過定點飽和突變對RhaD的152位酪氨酸進(jìn)行半理性改造，提高該酶對D-甘油醛的立體選擇性，使得專一性合成D-阿洛酮糖。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

大腸桿菌MG1655、XL10-gold和Rosetta(DE3)本實驗室保存。菌株XL10-gold/pET28a-rhaD、Rosetta/pET28a-rhaD為實驗室前期構(gòu)建。用于基因擴增的引物在華大基因合成。

1.2 酶、試劑及耗材

過氧化氫酶(catalase)、酸性磷酸酶(acid phosphatase from sweet potato，AP)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、硫酸卡那霉素(Kan)、磷酸二羥基丙酮(DHAP)、D-甘油醛(D-glyceraldehyde)、D-山梨糖(D-sorbose)、D-阿洛酮糖(D-psicose)購于Sigma-Aldrich；Ni2+親和層析柱購自于GE；BCA蛋白濃度測定試劑盒(加強型)購置于碧云天；Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm×7.8 mm)購于Bio-Rad公司；TLC硅膠鋁板購于Merck KGaA；定點突變試劑盒購自北京全式金生物科技有限公司；PCR反應(yīng)所需試劑均購買于TaKaRa公司；質(zhì)粒小量制備試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 培養(yǎng)基及其他溶液配制

LB培養(yǎng)基：酵母浸出物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L(固體培養(yǎng)基)，高壓滅菌(121 ℃，20 min)。

TB培養(yǎng)基：酵母浸出物24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，K2HPO4·3H2O 16.4 g/L，KH2PO42.31 g/L，甘油0.4%(V/V)。

用于蛋白純化緩沖液：裂解、平衡緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl(pH=7.8)，150 mmol/L NaCl；洗滌緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl(pH=7.8)，150 mmol/L NaCl，60 mmol/L imidazole；洗脫緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl(pH=7.8)，150 mmol/L NaCl，500 mmol/L imidazole；脫鹽緩沖液：25 mmol/L Tris-HCl(pH=7.8)，50 mmol/L NaCl。

1.4 主要儀器

iMarK酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；蛋白純化系統(tǒng)AKTAavant；高效液相色譜HPLC(HITACHI)；超聲波細(xì)胞粉碎機(南京新辰生物科技有限公司)。

1.5 表達(dá)載體pET28a-rhaDY152X152位突變的構(gòu)建

為了對RhaD152位的酪氨酸進(jìn)行定點飽和突變，分別以丙氨酸等19種氨基酸來代替酪氨酸。以本實驗室質(zhì)粒保藏菌提取目的質(zhì)粒pET28a-rhaD，設(shè)計并合成定點突變引物共19對 (表1)。

表1 RhaD152位的酪氨酸定點飽和突變引物Table 1 Primers for site-saturation mutagenesis oftyrosine 152 of RhaD

注：下劃線上的字母代表突變位點。

以152位酪氨酸突變成丙氨酸為例進(jìn)行說明，PCR擴增合成氨基酸突變后的質(zhì)粒pET28a-rhaDY152A。50 μL體系如下：質(zhì)粒(10 ng)，上下游引物(10 μmol/L)，2×TransStart FastPfu PCR Super Mix (25 μL)。PCR條件：94 ℃，2～5 min；94 ℃，20 s；55 ℃，20 s；72 ℃，7 min，20個循環(huán)；72 ℃，10 min)。電泳檢測目的條帶大小正確后，用突變試劑盒DMT酶，37 ℃孵育1 h。取2～5 μL DMT酶消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并涂布到LB (Kan)(50 μg/mL)抗性平板上。挑選單菌落提取質(zhì)粒酶切鑒定及測序，最終得到19種RhaD 152位酪氨酸定點突變的表達(dá)載體。

1.6 RhaD野生型及突變體蛋白在大腸桿菌Rosetta中的誘導(dǎo)表達(dá)

將攜帶野生型和突變型質(zhì)粒(如pET28a-rhaD和pET28a-rhaDY152X)轉(zhuǎn)化到Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂到LB(Kan)平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，然后挑選單菌落接種LB(Kan)液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，取2 mL菌液接種到200 mL TB(Kan)液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)。3～4 h后OD600=0.6～0.8，轉(zhuǎn)16 ℃培養(yǎng)同時加入200 μL IPTG(終濃度0.1 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)。(在此之前取500 μL菌液作為誘導(dǎo)前樣品)，加入誘導(dǎo)劑后，16 ℃繼續(xù)培養(yǎng)20 h(取誘導(dǎo)后500 μL菌液作為誘導(dǎo)后樣品)，離心收集菌體(8 000g，2 min，4 ℃)，準(zhǔn)備純化。

1.7 RhaD野生型以及突變體蛋白的分離純化

基于前期研究基礎(chǔ)上[20-21]，我們探索出適合純化醛縮酶用以生產(chǎn)稀有糖的一系列方法流程。即用15～20 mL預(yù)冷的裂解緩沖液重懸以上收集的菌體，超聲破碎。破碎約25 min后(超聲破碎5 s，間隔5 s)，鏡檢直至破碎完全。將破碎后的菌體離心(12 000g，30 min，4 ℃)，利用蛋白純化系統(tǒng)AKTAavant純化上清中的蛋白(具體步驟：先用預(yù)冷的平衡緩沖液平衡鎳親和層析柱5 mL HisTrpTMHP；接著以1.5 mL/min上樣，上樣結(jié)束后，以預(yù)冷的洗滌緩沖液洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白；最后換洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫峰取樣并進(jìn)行SDS-PAGE檢測)。純化后的蛋白用超濾管脫鹽后用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.8 RhaD醛縮酶突變體的立體選擇性分析

以DHAP和D-甘油醛為底物的反應(yīng)體系如下:DHAP(0.5 mol/L，5 μL，50 mmol/L)，D-甘油醛(0.5 mol/L，3 μL，30 mmol/L)，RhaD醛縮酶(終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL)，加入50 mmol/L Tris-HCl (pH=7.8)緩沖液使反應(yīng)終體積為50 μL。30℃反應(yīng)12 h后，取1 μL反應(yīng)液進(jìn)行TLC檢測[展開劑為正V(丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=2∶1∶1]，茴香醛染色檢測酮糖-1-磷酸的生成。用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值為4.6，然后加入0.25 μL AP，30 ℃反應(yīng)10 h，取1 μL TLC檢測，用0.1 mol/L NaOH將pH調(diào)至7.0終止反應(yīng)。反應(yīng)上清液用HPLC檢測分析稀有糖的種類及比例。HPLC檢測條件如下：Bio-Rad Aminex HPX-87H，流動相為5 mmol/L的稀硫酸水溶液，流速為0.5 mL/min，日立示差檢測器(HITACHI RI)，進(jìn)樣量為20 μL。D-阿洛酮糖、D-山梨糖的保留時間分別為11.23 min和12.55 min。采用相同條件進(jìn)行D-阿洛酮糖和D-山梨糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體pET28a-rhaDY152X152位突變的構(gòu)建

前期研究表明大腸桿菌來源的FucA醛縮酶的第113位的酪氨酸是參與醛受體分子結(jié)合的重要位點。通過NCBI中Blastp對大腸桿菌來源的RhaD和FucA進(jìn)行氨基酸序列比對。結(jié)果顯示：RhaD與FucA在酪氨酸位點上具有高度保守性，即RhaD第152位酪氨酸與FucA第113位酪氨酸對應(yīng)(圖3)。

圖3 RhaD和FucA氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of aldolases RhaD and FucA

以質(zhì)粒pET28a-rhaD為模板，經(jīng)過單酶切驗證擴增出完整質(zhì)粒大小約6 194 bp的條帶，rhaD基因片段大小為825 bp，pET-28a載體大小為5 369 bp，以pET-28a質(zhì)粒單酶切作為對照(圖4)，重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切，能夠切出rhaD基因大小的片段，與預(yù)期的結(jié)果相吻合，重組質(zhì)粒經(jīng)過測序表明突變成功。

1-DNA Marker (1 kb plus)；2-rhaD片段(825 bp)；3-質(zhì)粒pET-28a經(jīng)EcoR I單酶切產(chǎn)物；4-PCR擴增得到重組質(zhì)粒pET28a-rhaDY152X EcoR I單酶切產(chǎn)物；5-重組質(zhì)粒pET28a-rhaDY152X EcoR I和BamH I雙酶切產(chǎn)物圖4 表達(dá)載體pET28a-rhaDY152X152位突變的構(gòu)建Fig.4 Construction of expression plasmid pET28a-rhaDY152X

2.2 RhaD突變體蛋白在大腸桿菌Rosetta中的誘導(dǎo)表達(dá)

以丙氨酸和色氨酸分別取代152位的酪氨酸的RhaD突變體蛋白的表達(dá)純化為例進(jìn)行說明。根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果分析(圖5)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在約30 kDa處出現(xiàn)一條蛋白條帶(3號泳道)，與預(yù)期結(jié)果一致，對比之下，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體(2號泳道)沒有出現(xiàn)目的帶，說明RhaD突變體蛋白成功表達(dá)。細(xì)胞破碎上清液，經(jīng)過鎳柱純化后，蛋白純度在95%以上。

1-蛋白Marker；2-誘導(dǎo)前全細(xì)胞；3-誘導(dǎo)20 h后的全細(xì)胞；4-細(xì)胞裂解上清；5-純化后的RhaD圖5 SDS-PAGE 檢測RhaD突變體的表達(dá)與純化Fig.5 SDS-PAGE analysis of expression and purification of RhaD mutants

2.3 TLC檢測RhaD突變體的酶活

以DHAP作為供體分子，以D-甘油醛為受體分子，經(jīng)純化后的RhaD突變體的催化，生成相應(yīng)的酮糖-1-磷酸。在酸性磷酸酶AP的作用下，脫掉磷酸基團得到相應(yīng)的酮糖。以突變體RhaD Y152A和RhaD Y152W為例進(jìn)行說明。TLC結(jié)果顯示(圖6)：兩種突變體均可以催化DHAP和D-甘油醛合成酮糖-1-磷酸并在TLC板上顯示深藍(lán)色(a箭頭所示)；用AP處理后，可以脫掉磷酸基團得到相應(yīng)的酮糖(b箭頭所示)。

2.4 HPLC分析RhaD突變體的立體選擇性

a-為RhaDY152A突變體催化的反應(yīng)； b-RhaDY152W突變體催化的反應(yīng)1-D-甘油醛；2-DHAP；3-反應(yīng)0 h；4-反應(yīng)20 h(脫磷酸前產(chǎn)物)；5-脫磷酸后產(chǎn)物圖6 TLC分析RhaD突變體的活性Fig.6 TLC analysis of the activities of RhaD mutants

a-野生型RhaD催化的反應(yīng)；b-6種代表性的RhaD突變體傾向于生成D-山梨糖的反應(yīng)；c-RhaD Y152A突變體中傾向于生成D-阿洛酮糖的反應(yīng)圖7 HPLC分析RhaD突變體的立體選擇性Fig.7 HPLC analysis of the stereoselectivity of RhaD

為了分析RhaD突變體的立體選擇性，利用HPLC對反應(yīng)產(chǎn)物及其比例進(jìn)行檢測，并以野生型RhaD醛縮酶催化的反應(yīng)作為對照。前期結(jié)果表明，以DHAP和D-甘油醛作為底物，在野生型RhaD醛縮酶的作用下，生成D-山梨糖和D-阿洛酮糖兩種稀有糖并且兩種稀有糖的比例約為1∶1。如圖7-a所示，本結(jié)果與前期結(jié)果保持一致，兩者的比例接近與1∶1。在這19種RhaD突變體催化的反應(yīng)(表2)，突變體Y152W，Y152Q，Y152N，Y152D，Y152H，Y152E，Y152G，Y152K，Y152P，Y152S，Y152T，Y152V，Y152M共計13種均傾向于生成D-山梨糖，選取6種代表性的突變體的液相檢測圖(圖7-b所示)，最高比例10.8∶1(突變體Y152W)。突變體Y152F，Y152I，Y152R的立體選擇性保留與野生型一樣的趨勢，同時也存在部分表現(xiàn)為酶失活的失敗突變(Y152C，Y152L)。RhaDY152A催化的反應(yīng)傾向于生成D-阿洛酮糖(如圖7-c)，兩者的比例約為8∶1。

表2 RhaD所產(chǎn)稀有糖種類及其比例Table 2 Results of RhaD and mutants for rare sugarssynthesis and ratios

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明大腸桿菌來源的RhaD醛縮酶的第152位酪氨酸的定點飽和突變能夠顯著影響該酶的立體選擇性。其中RhaDY152A更傾向于生成D-阿洛酮糖，推測可能由于丙氨酸是空間位阻最小的氨基酸，對D-甘油醛在RhaD活性口袋中的定位有著重要影響，下一步的工作將通過測定該突變體的酶動力學(xué)參數(shù)來分析立體選擇性發(fā)生改變的原因。雖然RhaD Y152A突變體催化的反應(yīng)仍有少量的D-山梨糖產(chǎn)生，需要對更多的氨基酸位點進(jìn)行理性改造，使其能夠?qū)Ｒ恍缘睾铣筛吒郊又档腄-阿洛酮糖，這對于解決稀有糖同分異構(gòu)體的分離純化問題具有重要意義。

基于生物信息技術(shù)的日臻成熟，我們將采用計算機模擬對底物分子與酶分子進(jìn)行對接，分析系統(tǒng)能量最小化時，底物與酶分子發(fā)生相互作用的關(guān)鍵氨基酸。通過對酶分子(半)理性改造，找到能專一性合成高附加值D-阿洛酮糖的突變體，應(yīng)用到D-阿洛酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)。而這一設(shè)想的提出，對今后更多DHAP依賴II型醛縮酶的立體選擇性研究提供了理論依據(jù)和方法。