楊璐環(huán)，鄧一秒，吳希陽，陳振強(qiáng)，唐書澤*

1(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632) 2(暨南大學(xué) 食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院，廣東 廣州，510632) 3(暨南大學(xué) 光電工程系，廣東 廣州，510632)

阪崎腸桿菌(Cronobactersakazakii)是一種危及嬰幼兒健康的條件致病菌。1961年，英國(guó)首次報(bào)道了兩例由阪崎腸桿菌引起的新生兒腦膜炎病例，兩個(gè)嬰兒在出現(xiàn)癥狀后的兩天內(nèi)均死亡[1]。之后，科研人員從食品和環(huán)境中分離出阪崎腸桿菌，2002年LECLERCQ[2]等從奶酪、牛肉、蔬菜、臘腸中分離到阪崎腸桿菌, 但目前還不能確定該菌的自然宿主。近年，在美國(guó)、日本、墨西哥、阿根廷等地都出現(xiàn)過奶粉阪崎腸桿菌感染嬰幼兒病例[3-6]。低體重、早產(chǎn)嬰兒與免疫缺陷嬰兒是易感人群，感染癥狀主要是腦膜炎、菌血癥和小腸結(jié)腸炎[7]。在中國(guó)，雖阪崎腸桿菌中毒事件的報(bào)道鮮少，但在廣州、甘肅、福建龍巖等多地市售嬰幼兒奶粉中曾分離出阪崎腸桿菌[8-10]。

多年來，學(xué)者主要研究的是浮游菌，但大多數(shù)細(xì)菌是以群體方式存在，即生物膜(biofilm)形式。阪崎腸桿菌主要以生物膜方式存在，附著在加工生產(chǎn)線、車間墻壁、地面等表面，是一個(gè)三維結(jié)構(gòu)菌細(xì)胞群體，被胞外聚合物(extracellular polymeric substance, EPS)及其基質(zhì)網(wǎng)包裹。其形成過程包括可逆附著期、不可逆附著期、菌落形成期、成熟期及老化脫落期[11]。時(shí)間、溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)條件、有機(jī)化合物、金屬離子尤其是二價(jià)離子如Ca2+、Mg2+、Cu2+等因素都會(huì)影響生物膜的形成。細(xì)菌生物膜極易出現(xiàn)在被忽略的隱蔽處如凹槽、空隙等，在食品加工過程中，食品通過接觸這些微小地方染菌，引發(fā)食品中毒。生物膜控制方法有超聲波法、消毒劑清洗消毒法等[12]。超聲波可以在鄰近表面的液體中產(chǎn)生空化氣泡，從而分散在生物膜的表面而去除生物膜[13]。DROR等[14]研究表明超聲波處理能有效去除87.5%的生物膜。超聲處理初始溫度、時(shí)間、功率等都能影響生物膜去除效果。BAUMANN等[15]對(duì)單核細(xì)胞李斯特菌生物膜研究結(jié)果表明超聲波與臭氧處理結(jié)合能有效去除食品不銹鋼表面生物膜。TORLAK等[16]認(rèn)為超聲波與苯扎氯銨聯(lián)合作用能導(dǎo)致生物膜中活細(xì)胞水平顯著降低。

阪崎腸桿菌近年來在食品中尤其是奶粉中的檢出率逐年增加，周漢洪等[17]對(duì)四川省達(dá)州市嬰幼兒食品阪崎腸桿菌污染情況進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)率高達(dá)26.83%。但對(duì)阪崎腸桿菌生物膜的形成因素和控制技術(shù)研究報(bào)道甚少，本文通過建立生物膜體外模型，測(cè)定生物膜含量并觀察其形態(tài)變化，探討阪崎腸桿菌生物膜形成條件，同時(shí)通過超聲波處理，研究超聲波作用對(duì)玻璃表面生物膜去除效果。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29544(含標(biāo)準(zhǔn)凍干菌株與菌株復(fù)蘇液)，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基 (TSB)：稱取15.0 g加入500 mL蒸餾水，混勻溶解后，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 (TSA)：稱取干粉20.0 g加入500 mL蒸餾水，121 ℃高壓滅菌15 min，待冷卻到45 ℃倒平板，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

pH=7.4 無菌磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solutions，PBS)(本實(shí)驗(yàn)室配置)； 結(jié)晶紫(Sigma);甲醇、體積分?jǐn)?shù)為33%冰乙酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；LIVE/DEADTMBacLightTMBacterial Viability Kit (L13152，含SYTO9/PI)；抗熒光淬滅劑(碧云天P0126)；指甲油 (浙江艷莊化妝品有限公司)。

1.3 主要儀器

多功能酶標(biāo)儀 (Infiniti M200pro，Switzerland)，帝肯貿(mào)易有限公司；6/96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，Costar；蓋玻片 (玻璃材質(zhì)，20 mm×20 mm)，載玻片(玻璃材質(zhì)，25 mm×75 mm)，江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司；智能數(shù)字超聲儀器(KQ-350D)，東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司；倒置生物顯微鏡 (BDS400)，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；激光共聚焦掃描顯微鏡 (LSM700)，德國(guó)Zeiss。

1.4 方法

1.4.1 菌種復(fù)蘇與活化

參照微生物檢測(cè)凍干質(zhì)控菌種阪崎腸桿菌使用說明書對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)蘇，開啟瓶蓋前需用體積分?jǐn)?shù)為75%酒精棉球?qū)ζ孔颖砻孢M(jìn)行消毒，所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。復(fù)蘇后的菌懸液于5 mL TSB培養(yǎng)基中以100 r/min、37 ℃下進(jìn)行搖床培養(yǎng)過夜。

1.4.2 菌種培養(yǎng)

取活化后的菌懸液100 μL涂布于TSA培養(yǎng)基，在生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取菌落在TSA中采用分區(qū)劃線稀釋法進(jìn)行平板劃線，培養(yǎng)繁殖過夜后形成阪崎腸桿菌單菌落。挑取單個(gè)菌落加入5 mL TSB培養(yǎng)基中，在37 ℃、100 r/min進(jìn)行搖床培養(yǎng)16 h至生長(zhǎng)穩(wěn)定期得到種子液[18]。對(duì)得到的菌懸液以4 500 r/min離心10 min，棄去上清液培養(yǎng)基，收集菌體沉淀，加5 mL 無菌PBS對(duì)菌體洗滌3次，棄去上清液浮游菌，使菌體重新懸浮于PBS溶液，用酶標(biāo)儀在595 nm測(cè)光密度(optical density, OD)，用無菌PBS調(diào)整菌懸液OD595值為0.5，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 阪崎腸桿菌BF體外模型建立與測(cè)定

1.4.3.1 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板BF形成與測(cè)定

96孔培養(yǎng)板在體積分?jǐn)?shù)為75%酒精浸泡過夜，超凈工作臺(tái)中紫外殺菌30 min。吸取100 μL菌液與100 μL TSB培養(yǎng)基加入至96孔培養(yǎng)板中混勻，以加入200 μL TSB培養(yǎng)基孔作為陰性對(duì)照，置生化培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，加入200 μL無菌PBS洗滌3次以洗去浮游菌。以結(jié)晶紫染色法測(cè)OD值，步驟參照 LEE[19]等進(jìn)行適當(dāng)修改：加100 μL體積分?jǐn)?shù)為10%甲醇固定15 min，吸出甲醇，自然風(fēng)干，加200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%結(jié)晶紫染色15 min，吸出結(jié)晶紫，用無菌蒸餾水清洗3次至無色，自然干燥后加200 μL 33%冰乙酸，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置20 min以完全溶解染料，多功能酶標(biāo)儀在595 nm測(cè)定其OD值。

1.4.3.2 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板載玻片BF形成

6孔培養(yǎng)板、蓋玻片在體積分?jǐn)?shù)為75%酒精浸泡過夜，超凈工作臺(tái)中紫外殺菌30 min。將蓋玻片轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板，并吸取200 μL菌液與5 mL TSB培養(yǎng)基加入至6孔培養(yǎng)板中。置生化培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，無菌PBS洗滌3次以洗去蓋玻片的浮游菌。

1.4.4 培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基初始pH值對(duì)阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

按1.4.3.1阪崎腸桿菌形成生物膜方法，用體積分?jǐn)?shù)為10% HCl和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% NaOH調(diào)節(jié)配制初始pH值為2.0、3.0、5.0、6.5、7.0、7.5、8.0、10.0、12.0的TSB培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌15 min后，將其分別放于4、25、37、45、55 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，作空白對(duì)照。按1.4.3.1操作測(cè)定OD值，每組試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)平行，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.5 倒置顯微鏡觀察37 ℃下不同pH值生長(zhǎng)條件下的生物膜

按1.4.3.1阪崎腸桿菌形成生物膜方法，配制初始pH值為2、5、7.5、10、12的TSB培養(yǎng)基，采用結(jié)晶紫染色法在倒置顯微鏡觀察生物膜，96孔板可直接放在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.6 培養(yǎng)基成分對(duì)阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

按1.4.3.1操作，各組分別以不加NaCl，CaCl2，MgCl2，CuSO4，乙二胺四乙酸 (ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA) 作為陽性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h，不加菌液培養(yǎng)基作陰性對(duì)照。按1.4.3.1操作測(cè)定OD值，每組試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)平行，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4.6.1 鹽度對(duì)阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

向TSB培養(yǎng)基中添加NaCl至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%，121 ℃高壓滅菌15 min后按1.4.3.1操作測(cè)定OD值。

1.4.6.2 無機(jī)鹽Ca2+、Mg2+、Cu2+對(duì)阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

分別配制含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%、0.03%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%的CaCl2的TSB培養(yǎng)基；配制含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%的MgCl2的TSB培養(yǎng)基；配制含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%、0.10%、0.30%、0.50%、0.80%、1.00%、1.50%、2.00%的CuSO4的TSB培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌15 min后按1.4.3.1操作測(cè)定OD值。

1.4.6.3 有機(jī)化合物EDTA對(duì)阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

配制含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的EDTA的TSB培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌15 min后按1.4.3.1操作測(cè)定OD值。

1.4.7 超聲波法對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用

1.4.7.1 超聲波法對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜處理及平板菌落計(jì)數(shù)法

按1.4.3.2處理后將洗好的蓋玻片轉(zhuǎn)移至裝有10 mL無菌水的無菌離心管中，密封。對(duì)其進(jìn)行超聲波處理，混勻所得菌懸液，將其以十倍稀釋法進(jìn)行稀釋，選取合適的梯度以涂布平板法進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行。若不進(jìn)行稀釋，則培養(yǎng)過夜后，培養(yǎng)基上的菌落會(huì)成片，致無法計(jì)數(shù)。從冰箱拿出的TSA培養(yǎng)基需倒置放入37 ℃培養(yǎng)箱中靜置2 h，防止培養(yǎng)基含水分從而稀釋菌液且延長(zhǎng)涂布時(shí)間。吸取100 μL菌液滴加至滅菌的TSA培養(yǎng)基中，用涂布器進(jìn)行涂布，使菌液均勻分布，于37 ℃培養(yǎng)16～24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。計(jì)算公式如下：

玻璃表面脫落 菌落數(shù)(CFU/cm3)=

(1)

1.4.7.2 超聲初始溫度對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用的影響

設(shè)定超聲波功率為180 W，分別在超聲初始溫度為20 、25 、30 、35 、40 、45 、50 、55 ℃超聲處理5 min，按1.4.7.1以平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄結(jié)果并計(jì)算出玻璃表面脫落菌落數(shù)，以確定最佳的超聲初始溫度。

1.4.7.3 超聲時(shí)間對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用的影響

設(shè)定超聲波初始溫度為30 ℃，超聲功率為180 W，分別對(duì)其進(jìn)行超聲處理2、5、8、11、14、17、20、23 min，按1.4.7.1以平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄結(jié)果并計(jì)算出玻璃表面脫落菌落數(shù)，以確定最佳的超聲時(shí)間。

1.4.7.4 激光共聚焦掃描(CLSM)觀察超聲初始溫度對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用影響

按照活SYTO9/PI染料試劑盒說明書進(jìn)行操作，加100 μL 染料，染色孵育15 min，在載玻片上滴加1滴抗熒光淬滅劑，指甲油封片，于激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，采集圖像。

1.4.7.5 激光共聚焦掃描(CLSM)觀察超聲時(shí)間對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用影響

按1.4.7.4步驟操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度與培養(yǎng)基初始pH值對(duì)阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值和生物膜形成密切關(guān)系(見圖1)。阪崎腸桿菌在37 ℃生長(zhǎng)狀況最好，45 ℃環(huán)境下的阪崎腸桿菌生物膜量比25 ℃時(shí)多，這與魏奇等[20]報(bào)道一致。在4 ℃低溫下，阪崎腸桿菌基本不生長(zhǎng)，在55 ℃環(huán)境中培養(yǎng)阪崎腸桿菌，其也形成了一定數(shù)量的生物膜，證明了阪崎腸桿菌的耐高溫特性，也說明了在奶粉等食品中需要60 ℃以上才能達(dá)到殺滅阪崎腸桿菌目的。在一定的溫度下，阪崎腸桿菌的生長(zhǎng)受初始pH值的影響較大，當(dāng)培養(yǎng)基為堿性時(shí)，其生長(zhǎng)嚴(yán)重受到抑制，當(dāng)培養(yǎng)基為酸性時(shí)，其生長(zhǎng)也受到抑制，但影響相對(duì)較小。當(dāng)初始pH值為2.0～7.5時(shí)，生物膜量隨之增加，初始pH值為7.5的生物膜量最大，最適合阪崎腸桿菌生長(zhǎng)。當(dāng)初始pH值為8.0～12.0時(shí)生物膜量隨之迅速減少，且pH值為2.0時(shí)的生物膜量比初始pH值為12.0時(shí)多，pH值為12.0時(shí)基本不形成生物膜，說明阪崎腸桿菌具有耐酸性。

圖1 阪崎腸桿菌生物膜培養(yǎng)光密度值隨培養(yǎng)基初始pH值與溫度的變化Fig.1 Influence of medium initial pH and temperature on the opticaldensity of Cronobacter sakazakii

2.2 倒置顯微鏡觀察37℃下不同pH值生長(zhǎng)條件下的生物膜

圖2-a為空白對(duì)照組圖，即未加入菌懸液的TSB培養(yǎng)基組。圖中未觀察到紫色菌體，表明無生物膜形成。圖2-b為培養(yǎng)基初始pH值2.0時(shí)顯微鏡觀察圖，可明顯看出其已有少量生物膜形成。圖2-c顯示，培養(yǎng)基初始pH值為5.0時(shí)的生物膜量比培養(yǎng)基初始pH值為2.0時(shí)多，且染色顏色深，證明生物膜較成熟，胞外多糖與結(jié)晶紫形成緊密。圖2-d為阪崎腸桿菌在最適培養(yǎng)基初始pH值為7.5時(shí)觀察圖，可看出其生物膜已經(jīng)完全成熟。圖2-e表明，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值增大為10.0時(shí)，生物膜含量大大降低。從圖2-f可看出，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為12.0時(shí)，幾乎不形成生物膜。圖2-b與圖2-f比較，培養(yǎng)基初始pH值為酸性時(shí)的生物膜量比培養(yǎng)基初始pH值為堿性時(shí)要多，進(jìn)一步說明阪崎腸桿菌的耐酸特性。

圖2 不同pH值下阪崎腸桿菌生物膜結(jié)晶紫染色倒置顯微鏡鏡檢 10×20(結(jié)晶紫染色×200)Fig.2 Inverted microscope observations of Cronobacter sakazakii biofilm by crystal violet staining with different pH注：a為空白對(duì)照組，b～f分別表示在培養(yǎng)基初始pH為2.0、5.0、7.5、10.0、12.0條件下阪崎腸桿菌生物膜倒置顯微鏡下觀察圖。

2.3 培養(yǎng)基成分對(duì)阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

2.3.1 鹽度對(duì)阪崎腸桿菌生物膜形成影響

阪崎腸桿菌生物膜在培養(yǎng)基鹽度0.5%～3.0%范圍內(nèi)形成狀況較好，OD值比較高(見圖3)。鹽度2.5%時(shí)，為阪崎腸桿菌生長(zhǎng)最優(yōu)參數(shù)。隨著鹽度增長(zhǎng)，阪崎腸桿菌生長(zhǎng)被抑制，生長(zhǎng)速率降低，鹽度為3.0%～7.0%時(shí)，生物膜量持續(xù)下降，但鹽度為7.0%時(shí)，仍有一定的生物膜形成。

2.3.2 無機(jī)鹽Ca2+、Mg2+、Cu2+對(duì)阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

圖4為無機(jī)鹽Ca2+、Mg2+、Cu2+對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下測(cè)的OD595nm值。CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較低時(shí)，CaCl2明顯促進(jìn)生物膜的形成，待CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.50%，達(dá)到最高生物膜量，但隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，生物膜生長(zhǎng)被抑制。在Ca2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于2.00%時(shí)，生物膜量總體呈上升趨勢(shì)(見圖4-A)。CHEN等[21]通過研究Ca2+對(duì)副溶血弧菌影響后指出，Ca2+可能是可交聯(lián)的陰離子基質(zhì)聚合物，當(dāng)Ca2+濃度增加，使得Ca2+飽和，其可屏蔽靜電相互作用并改變生物膜，使得形成的生物膜量下降。

MgCl2總體上是促進(jìn)生物膜形成(見圖4-B)，MgCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%～1.50%時(shí)，生物膜量持續(xù)增加，1.50%時(shí)達(dá)到最大。Mg2+通過對(duì)負(fù)電荷的吸引，使菌體粘附于載體的機(jī)會(huì)增大[22]。當(dāng)濃度再升高時(shí)，生物膜形成量降低，SONG和LEFF[23]研究Mg2+對(duì)熒光假單胞菌的影響規(guī)律，表明Mg2+改變了生物膜結(jié)構(gòu)，從而影響其生物膜的形成。

Cu2+明顯抑制生物膜形成(圖4-C)。Cu2+在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50%時(shí)，生物膜量下降較明顯。當(dāng)Cu2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.50%時(shí)，幾乎不形成生物膜，其他試驗(yàn)組的生物膜量也明顯低于對(duì)照組。Cu2+是重金屬離子，毒性較強(qiáng)，抑制生物膜活性，減少EPS分泌[24]。

圖4 無機(jī)鹽對(duì)阪崎腸桿菌生物膜形成的影響Fig.4 Effect of inorganic salts on Cronobacter sakazakii biofilm formation

2.3.3 有機(jī)化合物EDTA對(duì)阪崎腸桿菌生物膜形成的影響

圖5結(jié)果表明，添加0.2%EDTA，生物膜量稍增加，EDTA濃度增加，生物膜形成受到明顯抑制，添加2.5%EDTA時(shí)，生物膜幾乎不形成。 EMMAJ[25]等研究隱球菌生物膜形成影響因素時(shí)，發(fā)現(xiàn)EDTA通過影響Ca2+、Mg2+的運(yùn)輸，抑制生物膜形成。

圖5 EDTA對(duì)阪崎腸桿菌生物膜形成的影響Fig.5 Effect of EDTA on Cronobacter sakazakii biofilm formation

2.4 超聲波法對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用的影響

2.4.1 超聲初始溫度對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用的影響

超聲初始溫度對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌去除作用有一定的影響(見圖6)。超聲初始溫度低意味著超聲過程中產(chǎn)生的熱量少，隨著超聲初始溫度的升高，脫落的活菌數(shù)越多，初始溫度為30 ℃時(shí)，效果最好。當(dāng)初始溫度繼續(xù)升高，脫落的活菌數(shù)下降，但仍較高，當(dāng)初始溫度超過50 ℃時(shí)，超聲產(chǎn)熱過多導(dǎo)致阪崎腸桿菌失活，從而使活菌脫落數(shù)降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波解離阪崎腸桿菌菌株生物膜最優(yōu)超聲初始溫度為30 ℃。

圖6 超聲波初始溫度對(duì)阪崎腸桿菌玻璃表面生物膜去除影響Fig.6 Effect of ultrasonic initial temperature on lg(CFU/cm3) elimination of Cronobacter sakazakii biofilm on glass surface

2.4.2 超聲時(shí)間對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用的影響

超聲時(shí)間對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除作用有顯著影響(見圖7)。

圖7 超聲波時(shí)間對(duì)阪崎腸桿菌玻璃表面生物膜去除影響Fig.7 Effect of ultrasonic time on lg(CFU/cm3) elimination of Cronobacter sakazakii biofilm on glass surface

當(dāng)超聲時(shí)間為2 min時(shí)，生物膜脫落效果不顯著。這是因?yàn)樯锬び蟹€(wěn)定的結(jié)構(gòu)，需要一定的時(shí)間才能達(dá)到良好效果。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌脫落數(shù)大幅度上升，當(dāng)時(shí)間14 min時(shí)，脫落效果最好。但繼續(xù)進(jìn)行超聲處理，其脫落效果下降，這可能是因?yàn)樘幚頃r(shí)間越久，溫度越高。處理時(shí)間過長(zhǎng)與溫度過高導(dǎo)致菌體損失，致其死亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波解離阪崎腸桿菌菌株生物膜最優(yōu)超聲時(shí)間為14 min。

2.4.3 激光共聚焦顯微鏡 (CLSM) 觀察超聲初始溫度對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜脫落效果

圖8為激光共聚焦顯微鏡觀察SYTO9/PI染料對(duì)阪崎腸桿菌活死細(xì)胞染色變化直觀圖。圖8-a為空白對(duì)照組，即未經(jīng)過超聲波處理組，都是綠色熒光，此時(shí)的阪崎腸桿菌最多。圖8-b為超聲波初始溫度為20 ℃時(shí)活細(xì)胞量，蓋玻片上的活細(xì)胞數(shù)量減少，圖8-c為超聲波初始溫度為30 ℃時(shí)的活細(xì)胞量，玻片上生物膜幾乎全部脫落。圖8-d為超聲波初始溫度為50 ℃時(shí)的細(xì)胞，黃色代表死菌與活菌的重疊部分，阪崎腸桿菌不耐高溫，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，阪崎腸桿菌即會(huì)出現(xiàn)部分死亡現(xiàn)象。從而當(dāng)超聲波初始溫度超過一定溫度時(shí)，溫度越高，去除的活菌數(shù)越少。

圖8 CLSM觀察超聲溫度對(duì)阪崎腸桿菌生物膜去除效果Fig.8 Laser scanning confocal microscopy of the elimination effect of the ultrasonic temperature on Cronobacter sakazakii biofilm注：a～d為超聲波處理的Cronobacter sakazakii biofilm經(jīng)CLSM (63×/1.4油鏡)觀察圖。a為空白對(duì)照，未經(jīng)超聲波處理；b、c、d為實(shí)驗(yàn)組，超聲波初始溫度分別為20， 30，50 ℃。

2.4.4 激光共聚焦顯微鏡 (CLSM) 觀察超聲時(shí)間對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜脫落效果

圖9為激光共聚焦顯微鏡觀察SYTO9/PI染料對(duì)阪崎腸桿菌活死細(xì)胞染色變化直觀圖。圖9-a為空白對(duì)照組，即未經(jīng)過超聲波處理組，可以清楚看到活細(xì)胞量很多。圖9-b為超聲波處理2 min后的活細(xì)胞量，可以看出玻片上活菌數(shù)量大幅度減少，表明超聲波對(duì)活菌具有去除作用。圖9-c為超聲波處理14 min后的活細(xì)胞量，玻片上活菌幾乎全部脫落。圖9-d為超聲波處理23 min后的細(xì)胞，黃色代表死菌與活菌的重疊部分，即出現(xiàn)了死細(xì)胞，這是因?yàn)樘幚頃r(shí)間過久，溫度過高，導(dǎo)致菌體損傷，所以脫落的活細(xì)胞量減少。

圖9 CLSM觀察超聲時(shí)間對(duì)阪崎腸桿菌生物膜去除效果Fig.9 Laser scanning confocal microscopy of the elimination effect of the ultrasonic time on Cronobacter sakazakii biofilm注：a～d為超聲波處理的Cronobacter sakazakii biofilm經(jīng)CLSM(63×/1.4油鏡)觀察圖。a為空白對(duì)照，未經(jīng)超聲波處理； b、c、d為實(shí)驗(yàn)組，超聲波處理時(shí)間分別為2， 14，23 min。

3 結(jié)論

阪崎腸桿菌生物膜的形成受溫度、培養(yǎng)基pH值及培養(yǎng)基成分的影響。形成阪崎腸桿菌生物膜的最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，最適培養(yǎng)基pH值為7.5。通過結(jié)晶紫染色法在倒置顯微鏡下可直接觀察阪崎腸桿菌生物膜量的變化情況。2.5%以內(nèi)鹽度的培養(yǎng)基對(duì)生物膜形成有促進(jìn)作用。加入適當(dāng)?shù)腃aCl2和MgCl2均能提高生物膜量，CaCl2在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%、MgCl2在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.50%時(shí)能達(dá)到明顯的促進(jìn)作用。加入Cu2+、EDTA對(duì)生物膜有抑制作用，質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，抑制能力越強(qiáng)。一定功率的超聲波能夠促進(jìn)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜的脫落，其效果受超聲處理的溫度與時(shí)間影響。本試驗(yàn)結(jié)果得到的最佳超聲初始溫度為30 ℃，最佳超聲時(shí)間為14 min。激光共聚焦可直接觀察到超聲溫度和超聲初始時(shí)間對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌生物膜去除效果的影響。基于超聲波對(duì)玻璃表面阪崎腸桿菌的去除作用效果，該法可用于輔助其他滅菌法對(duì)嬰兒玻璃制奶瓶，盛裝食品玻璃瓶等玻璃制品上的阪崎腸桿菌進(jìn)行解離。