徐建妙，趙哲，陳策，柳志強

(浙江工業(yè)大學 生物工程學院， 浙江 杭州，310014)

L-2-氨基丁酸(L-2-aminobutyric acid,L-ABA)可通過酰胺化制備(S)-2-氨基丁酰胺鹽，是合成抗癲癇藥左乙拉西坦的關鍵中間體，也可通過還原末端羧基用于制備(S)-2-氨基丁醇，并被用來合成乙胺丁醇[1-2]。目前，L-2-氨基丁酸的合成主要由化學法合成和生物法合成?；瘜W法合成常需要昂貴的試劑，成本較高，工業(yè)生產不易采用，同時大量有機溶劑的使用還會造成環(huán)境污染[3-4]。生物法包括微生物發(fā)酵法和酶轉化法，酶轉化法是一種高選擇性反應，不同種類的酶可作用于不同構型和不同種類的特定底物，從而達到定向轉化的目的。目前酶法制備L-2-氨基丁酸主要有兩種，一種是對消旋 2-氨基丁酸進行酶法拆分制備[5]；另一種是以 2-酮丁酸為原料，通過脫氫酶[6-8]或者轉氨酶[9-15]來催化制備。但是由于2-酮丁酸價格較高，直接以其為原料不適合大規(guī)模工業(yè)生產。目前，比較常用的是用蘇氨酸脫氨酶(TD)催化價格相對低廉的L-蘇氨酸為2-酮丁酸，同時添加亮氨酸脫氫酶(LDH)在外加NAD+或NADH的基礎上，以甲酸脫氫酶(FDH)催化甲酸銨用于輔酶NADH的循環(huán)再生(圖1)。

圖1 蘇氨酸脫氨酶、亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶偶聯催化合成L-2-氨基丁酸工藝路線Fig.1 Synthesis of L-2-ABA by coupling TD, LDH and FDH

相對于其他NADH輔酶再生體系，甲酸銨/甲酸脫氫酶用于NADH輔酶再生體系優(yōu)勢明顯。例如，其反應具有不可逆性，所產生的副產物CO2對反應體系無任何不良影響，也易于后期產品的分離提取[16]。但是，目前報道的不同種類來源的甲酸脫氫酶催化活力普遍較低，蛋白表達的可溶性偏低，底物的轉化率不高，不利于后期工業(yè)化應用。本論文主要是對實驗室構建好的重組菌表達甲酸脫氫酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，用于后續(xù)的催化反應，并對催化反應工藝進行探索，以尋找一條底物轉化率高，成本低廉并能實現工業(yè)化生產L-2-氨基丁酸的生產路徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-蘇氨酸(L-Thr)，甲酸銨，阿拉丁公司；NAD+, 上海生工。重組大腸桿菌Escherichiacoli-BL21(DE3)/pET28b-FDH (FDH的基因片段來自Fusariumgraminearum)，由實驗室構建并保藏。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀，Eclipse XD8-C18(5 μm 4.6 mm×250 mm)，美國戴安公司；恒溫水浴鍋，上海一恒科技；低溫離心機，美國Beckman Coulter公司；ME104E型電子天平，Mettler-Toledo儀器有限公司。5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，松下健康醫(yī)療器械株式會社。多功能酶標儀，Molecular Devices；全自動旋光儀，美國魯道夫公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基與發(fā)酵條件

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨15 g/L、酵母粉 10 g/L、NaCl 10 g/L、甘油 12 g/L、(NH4)2SO45 g/L 、KHPO41.36 g/L、K2H2PO4·3H2O 2.28 g/L、MgSO4·7H2O 0.375 g/L，在 121 ℃滅菌 20 min，接種時添加無菌的卡那霉素。

種子培養(yǎng): 從甘油管中吸取50 μL菌液接入裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的搖瓶，并加入50 μL質量濃度 50 mg/L卡那霉素，37 ℃，150 r/min恒溫培養(yǎng)12 h。

搖瓶培養(yǎng)及誘導：培養(yǎng)基用LB培養(yǎng)基，種子液以1%(v/v)的接種量及100 μL質量濃度為50 mg/L的卡那霉素轉接至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，180 r/min的搖床上培養(yǎng)，待OD600值為0.6～0.8時，加入IPTG, 降溫誘導培養(yǎng)。結束后，于8 000 r/min，4 ℃，離心10 min收集菌體，將菌體于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

發(fā)酵培養(yǎng)及誘導: 培養(yǎng)基用發(fā)酵培養(yǎng)基，將種子液按 5%接種量接種并添加卡那霉素于發(fā)酵培養(yǎng)基，調節(jié)pH 7.0，控溫37 ℃，攪拌轉速450 r/min ，待OD600值為8時降溫至22 ℃，加入合適濃度的誘導劑乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)。發(fā)酵結束后，發(fā)酵液于4 ℃，8 000 r/min離心15 min，收集菌體，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分析方法

衍生化條件：50 μL 1% 2,4-二硝基氟苯乙腈溶液、100 μL待測樣品以及100 μL 0.5 mol/L的NaHCO3溶液，60 ℃避光反應60 min，進樣檢測。色譜條件：液相柱 Eclipse XD8-C18(5 μm 4.6 mm×250 mm) ，流動相：0.02 mol/L的磷酸氫二鈉(pH=7.2)∶乙腈=70∶30，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：360 nm。原理：在堿性條件下，氨基酸的游離末端NH2與2,4-二硝基氟苯發(fā)生親核芳環(huán)取代反應后，生成黃色的二硝基苯氨基酸衍生物，可用HPLC進行定量測定。

菌體密度測定：菌體密度以OD600表示，將發(fā)酵液稀釋一定倍數后用紫外分光光度計于600 nm處測定吸光值。菌體破碎液的制備: 發(fā)酵所得菌體用 0.1 mol/L、pH 8.5磷酸鹽緩沖液懸浮，置于超聲破碎儀中破碎。超聲破碎條件：工作功率300 W，工作 1 s，間歇 1 s，破碎時間20 min。破碎液于 4 ℃，8 000 r/min離心 15 min，取上清液經Ni柱純化后用于酶蛋白含量及酶活測定。蛋白含量測定選用凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒。酶活測定用96孔板檢測NADH吸光值(340 nm對應的含量標準曲線作為參照)。1 U酶活定義為pH 7.5，35 ℃下每分鐘催化生成1 μmoL NADH所需的酶量。1 L催化反應體系控制攪拌轉速500 r/min,恒溫35 ℃，開始時投加120 g的L-蘇氨酸和120 g的甲酸銨，0.03 g NAD+，3 h添加30 g蘇氨酸和0.02 g NAD+，反應6 h添加30 g蘇氨酸和0.03 g NAD+，反應8 h在反應中添加0.02 g NAD+。

2 結果與分析

2.1 搖瓶水平對重組菌表達甲酸脫氫酶蛋白的優(yōu)化

2.1.1 誘導溫度的確定

設置16、18、20、22、24、26和28 ℃這7個溫度梯度，誘導時間16 h，IPTG濃度0.1 mmol/L。由圖2可以看出，溫度對外源蛋白的表達影響較大，當誘導溫度為16 ℃時，表達的蛋白基本可溶，隨著誘導溫度的逐漸升高，包涵體也逐漸增多，當誘導溫度超過24 ℃時，沉淀中的蛋白含量超過了上清液中的。

A～G-分別是在誘導溫度16、18、20、22、24、26和28 ℃下培養(yǎng) E. coli BL21-FDH 的菌體破碎上清物；a～g為相對應的沉淀物圖2 不同誘導溫度下FDH的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of FDH at different induced temperatures

隨著溫度的升高，細胞破碎液上清中的蛋白濃度略有下降，但是沉淀中的蛋白隨著溫度的升高，明顯增加，這也說明隨著溫度的升高，大部分蛋白都沒有得到正確折疊，從而形成了包涵體。取等量的7組菌體破碎液與蘇氨酸脫氨酶及亮氨酸脫氫酶粗酶液匹配，外加輔酶NAD+，底物L-蘇氨酸，輔底物甲酸銨。圖3顯示，隨著誘導溫度的降低，外源表達的甲酸脫氫酶對于催化反應進程有促進。綜合考慮選用22 ℃作為后期誘導蛋白表達的合適溫度。

圖3 不同誘導溫度下表達的甲酸脫氫酶對催化反應進程的影響Fig.3 Time course of production of L-ABA by FDH using different induced temperatures

2.1.2 IPTG誘導濃度的確定

確定誘導溫度為22 ℃，設置0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 mmol/L IPTG誘導劑濃度對目的蛋白進行誘導表達，從圖4的蛋白膠圖可以看出，添加0.01 mmol/L的 IPTG后目的蛋白的表達量相對于其他幾組的蛋白表達量較少。隨著誘導劑濃度的提高，蛋白表達并沒有明顯提高。圖5的結果也顯示，采用0.01 mmol/L的IPTG誘導的菌體用于催化反應，底物轉化率只有70%，但是過高的濃度也不會有效促進催化反應的進程。綜合考慮選用0.1 mmol/L IPTG作為后期誘導蛋白表達的誘導劑。

A～F-分別是在誘導劑濃度0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 mmol/L下培養(yǎng)E. coli BL21-FDH 的菌體破碎上清物； a～f-相對應的沉淀物圖4 不同誘導劑濃度下FDH的SDS-PAGE檢測Fig.4 SDS-PAGE analysis of FDH at different inducer concentrations

圖5 不同濃度IPTG誘導下表達的甲酸脫氫酶對催化反應進程影響Fig.5 Time course of production of L-ABA by FDH using different IPTG concentration

2.1.3 誘導時間的確定

確定誘導溫度22 ℃，誘導劑IPTG濃度0.1 mmol/L ，設置誘導時間8、10、12、14、16、18和20 h。圖6表明隨著誘導時間的延長，目的蛋白的表達量也隨著增加。然而，包涵體也隨之增多。圖7隨著目的蛋白誘導時間的延長，一定程度上利于催化反應進程的進行。當誘導時間大于16 h，其催化反應進程不會隨著誘導時間的延長而明顯變化。綜合考慮選用16 h誘導時長作為后期誘導蛋白表達的時間。

A～G-分別是在誘導時長8、10、12、14、16、18和20 h下培養(yǎng) E. coli BL21-FDH 的菌體破碎上清物；a～f-相對應的沉淀物圖6 不同誘導時間下FDH的SDS-PAGE檢測Fig.6 SDS-PAGE analysis of FDH in different induction time

圖7 不同誘導時間誘導表達的甲酸脫氫酶對催化反應進程的影響Fig.7 Time course of L-ABA production by FDH at different induction time

經搖瓶水平優(yōu)化后甲酸脫氫酶的酶活為7.16 U/mg，相對于原始菌株搖瓶培養(yǎng)蛋白酶活6.88 U/mg并沒有顯著提高，然而可溶性目的蛋白表達量為52.12 mg/g，相對于原始菌株搖瓶培養(yǎng)蛋白表達量40.12 mg/g提高29.91%(圖8)。

1-原始菌株;2-搖瓶優(yōu)化圖8 純化后的甲酸脫氫酶SDS-PAGE結果Fig.8 SDS-PAGE analysis of purified FDH

2.2 5 L發(fā)酵罐水平對重組菌表達甲酸脫氫酶蛋白的優(yōu)化

2.2.1 不同乳糖濃度誘導表達產生的甲酸脫氫酶對催化反應進程的影響

用質量濃度分別為5、8、10、12.5、15、18 g/L的乳糖誘導外源甲酸脫氫酶蛋白的表達。由圖9可以看出，5 g/L的乳糖添加，8 h目的酶蛋白催化底物轉化率可達到88%左右，18 h催化底物轉化率可達到95%左右。隨著乳糖質量濃度增加，前期催化底物能力略有下降，后期皆能使底物完全轉化。故選用乳糖質量濃度為8 g/L。

圖9 不同乳糖濃度誘導表達產生的甲酸脫氫酶對催化活力影響Fig.9 Effect of lactose on FDH catalysis activity

2.2.2 不同誘導時間誘導表達產生的甲酸脫氫酶對催化反應進程影響

一般而言，外源蛋白在重組菌中會隨著誘導時間的延長，蛋白的表達量會有一定程度的增加。在5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體過程中，分別在誘導后8、10、12、14、16、18、20 h取樣檢測。由圖10可以看出隨著誘導時間的增加，目的酶蛋白的催化能力也隨著增加，16 h后基本趨于穩(wěn)定。故選用誘導時間16 h。

圖10 不同誘導時間誘導表達產生的甲酸脫氫酶對催化活力的影響Fig.10 Effect of induction time on FDH catalysis activity

在5 L發(fā)酵罐水平上對外源甲酸脫氫酶蛋白發(fā)酵條件進行優(yōu)化(見圖11)。結果表明，目的蛋白在誘導溫度22 ℃,誘導劑乳糖質量濃度8 g/L,誘導16 h下可溶性目的蛋白表達量為41.26 mg/g，相對于原始菌株發(fā)酵罐培養(yǎng)蛋白表達量為34.15 mg/g，提高20.82%。甲酸脫氫酶優(yōu)化后的酶活為6.12 U/mg，相比于原始菌株發(fā)酵培養(yǎng)得到目的蛋白酶活5.88 U/mg略有提高。

1-原始菌株;2-發(fā)酵罐優(yōu)化圖11 純化后的甲酸脫氫酶SDS-PAGE結果Fig.11 SDS-PAGE analysis of purified FDH

圖12 三酶偶聯催化合成L-2-氨基丁酸進程Fig.12 Time course of production of L-ABA by FDH coupling with TD and LDH

圖12表明，在1 L反應體系中，利用優(yōu)化后的甲酸脫氫酶，耦合蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶，底物L-蘇氨酸180 g，在9 h完全被轉化為L-2-氨基丁酸，轉化率99%以上，e.e.值99.5%以上，時空產率17.2 g/(L·h)。

3 結論

本文分別在搖瓶及5 L發(fā)酵罐水平對重組甲酸脫氫酶工程菌的外源表達條件進行優(yōu)化。結果表明:當誘導溫度為22 ℃，IPTG濃度為0.1 mmol/L(搖瓶培養(yǎng))、乳糖質量濃度8 g/L(發(fā)酵罐培養(yǎng))，誘導時間16 h時，有利于甲酸脫氫酶的外源表達。在5 L發(fā)酵罐水平目的蛋白由34.15 mg/g提高到41.26 mg/g，酶活由5.88 U/mg提高到6.12 U/mg。從研究結果可以看出，溫度是影響目的蛋白的可溶表達的最大因素，誘導時間對目的蛋白表達量具有比較顯著的影響，相對而言誘導劑的濃度對目的蛋白的影響并不顯著。利用5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得的菌體經破碎獲得的甲酸脫氫酶粗酶液匹配蘇氨酸脫氨酶粗酶液，亮氨酸脫氫酶粗酶液，在1 L反應體系中外加NAD+0.1 g, 底物L-蘇氨酸180 g，輔底物甲酸銨120 g，輔酶NAD及底物L-蘇氨酸分別采用分批添加策略，9 h左右底物L-蘇氨酸幾乎完全轉化為L-2-氨基丁酸。相比于一次性添加底物L-蘇氨酸及輔酶NAD+而言催化反應進程明顯縮短，底物催化濃度明顯提高，底物轉化率99%以上，時空產率17.2 g/(L·h)，e.e.值99.5%以上。反應底物濃度及時空得率均高于目前報道水平。本課題所采用的生產工藝及結果為后續(xù)L-2-氨基丁酸的工業(yè)化提供一定的參考依據。