翟磊，謝九艷，姚粟，宋振，楊玉新，程池*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100027) 2(新疆中亞食品研發(fā)中心(有限公司)，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊，830001)

戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)屬于厚壁菌門(Firmicutes)，芽胞桿菌綱(Bacilli)，乳桿菌目(Lactococcus)，乳桿菌科(Lactobacillaceae)，乳桿菌屬(Lactobacillus)。戊糖乳桿菌具有典型乳桿菌特征，呈規(guī)則的桿狀，屬于革蘭氏陽性菌，不產(chǎn)芽胞，無鞭毛，不運動，兼性厭氧，異型乳酸發(fā)酵[1]。自從1894年，F(xiàn)RED從酸菜中第一次分離到戊糖乳桿菌[2]，起初該菌種被劃分到植物乳桿菌中，1987年ZANON等通過DNA雜交和生理生化等試驗重新定義了該菌的分類地位，命名為戊糖乳桿菌[3]。

戊糖乳桿菌是目前公認(rèn)的安全菌，主要應(yīng)用于發(fā)酵乳制品，發(fā)酵肉制品，醬腌菜等發(fā)酵食品和一些青貯飼料中。戊糖乳桿菌作為益生菌可以產(chǎn)生分子量小，穩(wěn)定性高，有較廣的抑菌圖譜的戊糖乳桿菌素，對金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性致病菌和李斯特菌等革蘭氏陰性致病菌有一定的抑制作用[4-5]。戊糖乳桿菌可以利用戊糖如D-木糖等產(chǎn)生D-乳酸，快速的繁殖和強大的產(chǎn)酸耐酸特性能夠很好的降解玉米秸稈和短芒大麥草中的五碳糖，對于青貯飼料的應(yīng)用具有很大的潛在應(yīng)用價值[6]。戊糖乳桿菌還能利用生物柴油副產(chǎn)物廢甘油為直接原料進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生大量的乳酸，有效地減少環(huán)境污染，提高產(chǎn)品的利用率[7]；同時高產(chǎn)γ-氨基丁酸(GABA)戊糖乳桿菌的篩選[8]，對于微生物在藥用和保健功能食品研究領(lǐng)域有重要的意義。

新疆傳統(tǒng)發(fā)酵食品的制作和食用歷史悠久，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，而經(jīng)過長時間的自然馴化，傳統(tǒng)發(fā)酵食品中一些具有優(yōu)良特性的乳酸菌保留了下來。本研究建立乳酸菌功能評價模型，從耐酸耐鹽特性、產(chǎn)酸能力、抑菌能力、降解亞硝酸鹽能力和氨基酸脫羧酶能力等方面對分離于新疆特色辣椒的乳酸菌CICC 6294進(jìn)行鑒定和生物學(xué)特性研究。在此基礎(chǔ)上，將該菌株應(yīng)用于新疆特色辣椒發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與培養(yǎng)條件

菌株CICC 6294分離于新疆特色辣椒樣品，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (CICC)。菌株CICC 6294在MRS培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h。

用于抑菌試驗的菌種：大腸桿菌(Escherichiacoli) O157:H7 CICC 10907；腸沙門氏菌 (Salmonellaenteric) CICC 10871；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CICC 10790；單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes) CICC 21635，均來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 實驗試劑及設(shè)備

MRS培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、革蘭氏染色試劑盒，北京陸橋技術(shù)有限公司；API試劑條，生物梅里埃公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，OMEGA公司；GoldView，北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；溶菌酶，Sigma公司;蛋白酶，Merk公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 marker，北京天根生物有限公司。

光學(xué)顯微鏡Olympus BH-2，奧林巴斯有限公司；pH計FE20，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；紫外分光光度計7200，尤尼科(上海)儀器有限公司；溫度梯度PCR儀，Biometra公司；恒溫培養(yǎng)箱BHG-8082型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株CICC 6294多相分類學(xué)鑒定

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(OMEGA公司)提取菌株CICC 6294基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。以基因組DNA為模板，利用通用引物27F和1492R對該菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴增[9]。PCR擴增反應(yīng)體系按照PCR Mixture使用說明進(jìn)行配制(Tiangen公司)。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。利用引物21F (5′-CAYCCNGCHCGYGAYATGC-3′)和23R(5′-GGRTGRACCATVCCNGCHCC-3′)對pheS基因序列進(jìn)行擴增。PCR反應(yīng)體系同上，反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性2 min，94 ℃變性 1 min，46 ℃復(fù)性2min 15 s，72 ℃延伸1 min 15 s，3個循環(huán)；94 ℃變性 1 min 15 s，46 ℃復(fù)性1 min 15 s, 72℃延伸1 min 15 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖進(jìn)行檢測后，送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序。使用ContigExpress軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，將分析后結(jié)果遞交到EzBioCloud和NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析[10]，確定菌株CICC 6294與已知菌株的同源關(guān)系。采用MEGA 4軟件中的Clustal 功能對菌株CICC 10774與近緣種菌株的16S rRNA基因和pheS基因進(jìn)行多序列比對，并使用Neighbour3Joining法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育及分子進(jìn)化分析[11]。

菌株CICC 6294接種到MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h后，觀察菌落形態(tài)特征[12]。收集新鮮菌體，加入2.5%戊二醛4 ℃固定過夜。離心收集菌體，100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)漂洗3次。30%，50%，70%，85%，95%乙醇梯度脫水后100%乙醇脫水3次。脫水后使用儀器BAL-TEC CPD030進(jìn)行二氧化碳臨界點干燥。噴金-離子濺射儀 BAL-TEC SCD005進(jìn)行噴金后，使用掃描電鏡Hitachi SU8010進(jìn)行菌體形態(tài)觀察。使用API 50 CHL鑒定系統(tǒng)對菌株CICC 6294底物利用特征進(jìn)行測定[13]。

1.3.2 菌種CICC 6294生物學(xué)特性研究

挑取新鮮培養(yǎng)的單菌落接種到4 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h后作為接種種子液。菌種CICC 6294生物學(xué)特性研究均設(shè)置3次平行。

生長及產(chǎn)酸能力測定：將種子液按1%接種量接種于200 mL MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以不接種培養(yǎng)基作為對照，每隔2 h取樣測定600 nm下吸光值(OD600)，同時測定發(fā)酵液的pH值[14]。

耐鹽耐酸特性測定：將種子液按1%接種量接入分別含20、40、60、80和100 g/L NaCl以及入pH 2、3、4、5、6、7的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)48 h，測定600 nm下吸光值(OD600)，并記錄結(jié)果[15]。

亞硝酸鹽降解能力測定：將種子液按1%接種量接種于含125 μg/mL NaNO2的200 mL MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，每隔24 h定時取樣測定NaNO2含量。參考GB/T 5009.33—2003中的鹽酸萘乙二胺法進(jìn)行測定，不接種的MRS培養(yǎng)基(含125 μg/mL NaNO2)作為空白對照[16]。

氨基酸脫羧酶試驗：挑取新鮮培養(yǎng)的單菌落于3 mL無菌生理鹽水中研磨，制備成0.5 McFarland懸液，分別滴入氨基酸脫羧酶試驗的安培瓶中，每瓶3滴，并加無菌液體石蠟覆蓋培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)24 h后，觀察試驗管與對照管顏色變化，試驗管為紫色，對照管為黃色，結(jié)果為陽性；試驗管與對照管均為黃色，結(jié)果為陰性。

抑菌試驗：采用濾紙片法測定目標(biāo)菌株的抑菌性能。挑取新鮮培養(yǎng)的指示菌株，大腸桿菌 O157:H7 (Escherichiacoli, CICC 10907)，腸沙門氏菌 (Salmonellaenteric, CICC 10871)，金黃色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus, CICC 10790) 和單增李斯特菌 (Listeriamonocytogenes, CICC 21635)，將菌懸液濃度調(diào)至0.5 麥?zhǔn)蠞岫炔⒕鶆蛲坎荚赥SA培養(yǎng)基上，然后將濾紙片浸泡在200 μL培養(yǎng)48 h的菌株CICC 6294發(fā)酵液中，置于上述培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，記錄結(jié)果[17]。

1.3.3 發(fā)酵辣椒特性測定

將新疆辣椒清洗干凈打漿破碎后，將種子液按1%接種量接種于破碎辣椒中，同時加入3%糖和3%鹽，以不接乳酸菌的自然發(fā)酵辣椒為對照組，30 ℃恒溫連續(xù)發(fā)酵7 d。每天取樣測定發(fā)酵辣椒的pH值。按照GB/T 12456—2008：《食品中總酸的測定》中酸堿滴定法測定發(fā)酵辣椒的總酸含量[18]。使用HPLC法測定有機酸的種類和含量。按照GB 5009.33—2010：《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》測定發(fā)酵辣椒的亞硝酸鹽含量[19]。按照GB/T 5009.208—2008：《食品中生物胺含量的測定》使用HPLC法對發(fā)酵7 d的辣椒中生物胺的種類和含量進(jìn)行測定[20]。發(fā)酵辣椒特性測定均設(shè)置了3次平行，數(shù)據(jù)分析使用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 菌株CICC 6294 多相分類學(xué)鑒定

菌株CICC 6294在MRS瓊脂培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)48 h，菌落為乳白色，圓形，濕潤，邊緣整齊，表現(xiàn)為典型的乳桿菌菌落特征。顯微鏡下觀察，菌株呈桿狀，大小為0.4～0.5 μm×0.6～1.5 μm，單個，成對或者成堆排列，革蘭氏染色呈陽性。菌株CICC 6294電鏡照片見圖1，利用碳源產(chǎn)酸能力見表1。

圖1 菌株CICC 6294掃描電鏡圖Fig.1 The scanning electron microscope of strain CICC 6294

檢測項目結(jié)果檢測項目結(jié)果檢測項目結(jié)果檢測項目結(jié)果甘油+赤蘚糖醇-D-阿拉伯糖-L-阿拉伯糖+D-核糖+D-木糖+L-木糖-阿東醇-β-甲基-D-木糖苷-D-半乳糖+D-葡萄糖+D-果糖+D-甘露糖+L-山梨糖-L-鼠李糖-衛(wèi)矛醇-肌醇-甘露醇+山梨醇+α-甲基-D-甘露糖苷-α-甲基-D-葡萄糖苷+N-乙酰葡糖胺+w苦杏仁苷+熊果苷+七葉靈+水楊苷+D-纖維二糖+D-麥芽糖+D-乳糖+D-蜜二糖+D-蔗糖+D-海藻糖+菊糖-D-松三糖-D-棉籽糖+淀粉-糖原-木糖醇-D-龍膽二糖+D-土倫糖-D-來蘇糖-D-塔格糖-D-巖藻糖-L-巖藻糖-D-阿拉伯醇-L-阿拉伯醇-葡萄糖酸鉀-2-酮基-葡萄糖酸鹽-5-酮基-葡萄糖酸鹽-

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性；“+w”表示弱陽性。

將菌株CICC 6294擴增的16S rRNA基因序列測序遞交數(shù)據(jù)庫比對后(圖2)，與其親緣最近的是LactobacilluspentosusJCM 1558T，同源性為100%，然而同源率高于98.65%的模式菌種還包括Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumATCC 14917T，LactobacillusparaplantarumDSM 10667T，Lactobacillusplantarumsubsp.argentoratensisDKO 22T，LactobacillusfabifermentansDSM 21115T，Lactobacillusxiangfangensis3.1.1T和Lactobacillusmudanjiangensis11050T。因此，通過16S rRNA基因序列只能將菌株CICC 6294鑒定到乳酸桿菌屬(Lactobacillussp.)。在此基礎(chǔ)上，通過pheS基因比對分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，與菌株CICC 6294同源性最高的菌株為Lactobacilluspentosus(100%)，與其他菌株的同源性均在85%以下，因此綜合上述基因比對分析結(jié)果，菌株CICC 6294鑒定為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)，其16S rRNA 基因序列登錄號為KY694989，pheS基因序列登錄號為KY694987。

A-16S rRNA基因;B-pheS基因圖2 菌株CICC 6294系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic trees of strain CICC 6294注：采用MEGA5.0軟件，鄰位連接法顯示菌株與相關(guān)模式種系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次的相似度重復(fù)計算，圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示Bootstrap值大于50%數(shù)值，上標(biāo)的“T”表示模式菌株。

2.2 菌種CICC 6294生物學(xué)特征測定結(jié)果

生長曲線測定表明，菌株CICC 6294進(jìn)入對數(shù)期較快，培養(yǎng)10 h開始進(jìn)入對數(shù)期，培養(yǎng)36 h進(jìn)入穩(wěn)定期。產(chǎn)酸能力測定結(jié)果表明，菌株CICC 6294產(chǎn)酸速度較快，培養(yǎng)32 h pH值就降到4，最終pH值可以降到3.8(圖3-A)。由此可見，生長速度與產(chǎn)酸速度成正比，菌株CICC 6294進(jìn)入對數(shù)期較快，其產(chǎn)酸速率也較快。

耐酸耐鹽試驗結(jié)果表明，菌株CICC 6294生長pH值范圍為4～7，最適pH值為5。隨著pH值升高，菌株CICC 6294生長呈現(xiàn)升高后降低的趨勢，pH 5 條件下生長最旺盛，pH 2和pH 3條件下幾乎不能生長(圖3-B)；菌株CICC 6294生長與NaCl質(zhì)量濃度成反比，即隨著NaCl質(zhì)量濃度的升高，乳酸菌的生長受到明顯的抑制，菌株CICC 6294對NaCl耐受范圍為0～80 g/L，在含80 g/L NaCl培養(yǎng)基中最終生長的OD600能夠達(dá)到0.5(圖3-B)。因此，菌株CICC 6294具有較好的耐酸和耐鹽特性。

亞硝酸鹽降解能力測定試驗結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株降解的亞硝酸鹽越多。培養(yǎng)24 h后，菌株CICC 6294的亞硝酸鹽降解率可達(dá)到98.8%；培養(yǎng)30 h后，可達(dá)到100%(表2)。氨基酸脫羧酶試驗結(jié)果表明，菌株CICC 6294賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、色氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶4種氨基酸脫羧酶活性均顯陰性。抑菌試驗結(jié)果表明，菌株CICC 6294對于腸炎沙門氏菌的抑菌直徑可達(dá)26 mm，對于大腸桿菌的抑菌直徑可達(dá)到13 mm，對金黃色葡萄球菌抑菌直徑為19 mm，對單增李斯特菌的抑菌直徑為10 mm(表2)。

A-生長和產(chǎn)酸；B-耐酸和耐鹽圖3 菌株CICC 6294 生物學(xué)特性Fig.3 The biological properties of strain CICC 6294

生物學(xué)特性菌株CICC 6294亞硝酸鹽降解率/%a98.8亞硝酸鹽降解率/%b100氨基酸脫羧酶賴氨酸脫羧酶-鳥氨酸脫羧酶-色氨酸脫羧酶-精氨酸雙水解酶-抑菌直徑/mm腸炎沙門氏菌26大腸埃希氏菌13金黃色葡萄球菌19單增李斯特菌10

注：“a”表示菌株培養(yǎng)24 h后的亞硝酸鹽降解率，“b”表示菌株培養(yǎng)30 h后的亞硝酸鹽降解率；“-”表示陰性。

2.3 發(fā)酵辣椒特性測定

將菌株CICC 6294按1%接種量接種于破碎辣椒中，同時加入3%糖和3%鹽，以不接乳酸菌的自然發(fā)酵辣椒為對照組，30℃恒溫連續(xù)發(fā)酵7 d。辣椒發(fā)酵試驗結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵辣椒的pH值不斷下降，發(fā)酵7 d后，pH值不再明顯下降，因此7 d作為發(fā)酵的終點。自然發(fā)酵辣椒的終pH值在3.26，接種菌株CICC 6294的發(fā)酵辣椒，發(fā)酵終pH值在2.99，明顯低于自然發(fā)酵(圖4-A)。總酸含量測定表明，自然發(fā)酵辣椒的總酸含量僅為20.9 g/kg，接種菌株CICC 6294的發(fā)酵辣椒最終的酸含量能夠達(dá)到27.6 g/kg，明顯高于自然發(fā)酵辣椒(圖4-A)，這與發(fā)酵辣椒pH值測定是一致的。發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量測定結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的增加，亞硝酸鹽的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，發(fā)酵第2天亞硝酸鹽的含量達(dá)到峰值，自然發(fā)酵辣椒(CK)中亞硝酸鹽含量為6.5 mg/kg，而接種CICC 6294菌株的發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量為5.7 mg/kg(圖4-B)。接入菌株CICC 6294能夠顯著的降低發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽含量，發(fā)酵7 d亞硝酸鹽含量最低僅為0.81 mg/kg，遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量(2.63 mg/kg)。國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，蔬菜及其制品中亞硝酸鹽的含量不得超過20 mg/kg[21]，盡管自然發(fā)酵辣椒亞硝酸鹽的含量低于國家標(biāo)準(zhǔn)，但菌株CICC 6294的接入進(jìn)一步降低了發(fā)酵辣椒中的亞硝酸鹽，提高了發(fā)酵辣椒食用安全性。

圖4 發(fā)酵辣椒特性測定pH和總酸(A)以及亞硝酸鹽含量 (B)Fig.4 Properties of fermented chili pH and total acid (A) nitrite content(B)

生物胺測定結(jié)果表明，發(fā)酵辣椒中的生物胺主要為腐胺。接入菌株CICC 6294能夠顯著的降低發(fā)酵辣椒中腐胺的含量，腐胺的含量僅為3.19 μg/mL，遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵辣椒的19.36 μg/mL(表3)，這表明菌株CICC 6294的接入能很大程度的提高發(fā)酵辣椒的安全性。

表3 自然發(fā)酵和接種CICC 6294發(fā)酵辣椒的性能比較Table 3 Properties comparison between naturalfermentation chili and fermented chili with CICC 6294

3 討論

本研究通過多相分類學(xué)技術(shù)對分離于新疆特色發(fā)酵辣椒的菌株CICC 6294進(jìn)行鑒定，菌株CICC 6294符合乳酸菌的典型特征，系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析將該菌株鑒定為戊糖乳桿菌。

乳酸菌對低酸環(huán)境和滲透壓的耐受性也是作為發(fā)酵劑和潛在益生菌的必要條件[22]。本研究結(jié)果表明菌株CICC 6294生長速度快，產(chǎn)酸速度快，同時能夠耐受酸性和高滲環(huán)境，在pH 4條件下OD600能夠達(dá)到1.0，80 g/L NaCl條件下OD600能夠達(dá)到0.5，表現(xiàn)了良好的耐酸和耐鹽能力。亞硝酸鹽降解能力和生物胺生成能力也是乳酸菌作為果蔬發(fā)酵劑的重要參考因素[23-24]。菌株CICC 6294具有很強的亞硝酸鹽降解能力，在改良MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 h，亞硝酸鹽降解率可達(dá)到100%；多種氨基酸脫羧酶活性均顯陰性，生物胺生成能力較低；并且對4種食品常見致病菌具有抑制作用。上述生物學(xué)特性使得菌株CICC 6294具有作為果蔬發(fā)酵劑的潛力。

本研究將菌株CICC 6294應(yīng)用于發(fā)酵辣椒，與自然發(fā)酵相比，所得的發(fā)酵辣椒具有顯著的優(yōu)勢。接種該菌株的發(fā)酵辣椒總酸含量顯著提高，能夠達(dá)到27.6 g/kg；亞硝酸鹽的含量僅為0.81 mg/kg，遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵中亞硝酸鹽含量；生物胺的主要種類為腐胺，含量僅為3.19 μg/mL，遠(yuǎn)低于自然發(fā)酵辣椒，這些特性都與菌株的生物學(xué)特性是一致的。菌株CICC 6294 的接入能夠提高發(fā)酵辣椒的安全性，縮短發(fā)酵周期，作為乳酸菌發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵具有廣闊前景。