羅惠娣，毛楊毅，郭慧慧，張 麗，王志武，王志俊，李 俊，郭宏宇，薛麗娜，黨文慶

（山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 030032）

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，市場上對優(yōu)質(zhì)羊肉需求量日益增加，對優(yōu)種肉羊需求量也越來越多。因此，優(yōu)種肉羊快速繁殖技術(shù)也成為當前肉羊研究的熱點之一。在20世紀末和21世紀初，科學家們對優(yōu)種肉羊胚胎移植技術(shù)進行了深入研究，成倍增加了優(yōu)種肉羊數(shù)量。但傳統(tǒng)超數(shù)排卵和胚胎移植（Multiple ovulation and embryo transfer，MOET）技術(shù)僅用于成年羊，超數(shù)排卵只均可獲得8～10枚胚胎，世代間隔長，繁殖速度仍較慢。

澳大利亞南澳政府生殖與發(fā)育研究中心（South Australia Reproduction Institute，SARD） 研究與開發(fā)的“JIVET”技術(shù)（Juvenile in vitro embryo technology），是集幼畜的超數(shù)排卵與采卵、卵母細胞體外成熟與受精、受精卵體外培養(yǎng)與移植等技術(shù)為一體的新的快速繁殖技術(shù)體系。其原理是1～2月齡羔羊卵巢上有腔卵泡數(shù)量達到高峰，卵泡發(fā)育很少發(fā)生閉鎖，卵巢對生殖激素非常敏感。但由于羔羊腦垂體機能尚未健全，不能分泌足夠量的促性腺激素刺激卵巢活動，卵泡最終不能發(fā)育成熟而排卵。如果此階段利用外援促性腺激素誘導(dǎo)技術(shù)，平均每只羔羊可獲得卵母細胞80～160枚，是成年羊超數(shù)排卵獲得卵子的10倍左右，且世代間隔僅為成年羊的1/3時間，大大加快了優(yōu)種羊的繁殖速度。目前，國外科學家對優(yōu)種羊JIVET技術(shù)研究的較深，并取得了可喜成果［1-5］；國內(nèi)科學家安曉榮、汪立芹、郭洪、劉宗正、馬世科、陳曉勇等也分別對新疆自治區(qū)、遼寧省、山東省、青海省及河北省飼養(yǎng)的薩?？搜?、哈薩克羊、遼寧絨山羊和小尾寒羊等進行了JIVET技術(shù)研究［6-16］。但迄今為止，未見山西省有關(guān)優(yōu)種羊JIVET技術(shù)研究的報道，為此山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所聯(lián)合中國農(nóng)業(yè)大學進行幼齡杜泊羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的研究，以優(yōu)化優(yōu)種羊JIVET技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

2014年5月5—23日在山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物遺傳工程實驗室進行卵母細胞體外成熟和受精試驗，在晉中林山合作社羊場進行體外受精卵移植試驗。

1.2 材料

1.2.1 試驗羊 杜泊公羊、4～8周齡杜泊羊和受體羊由晉中林山合作社羊場提供。

1.2.2 凍精和發(fā)情羊血清 杜泊羊冷凍精液和發(fā)情羊血清（ESS）由山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物遺傳工程實驗室自制。

1.2.3 主要激素、試劑及耗材 羊栓（CIDR）、促卵泡素（FSH）、促黃體素（LH）、孕馬血清（PMSG）和 17β-雌二醇（17β-E2）均購自北京綠欣農(nóng)牧科技有限公司。M199、肝素鈉、牛血清白蛋白（BSA）、必需氨基酸（EAA）、非必需氨基酸（NEAA）等生物試劑和 CaCI2·2H2O、NaHCO3、KH2PO4等化學試劑均購自山西賽奧生物科技有限公司。四孔培養(yǎng)板購自Nunc公司，園底試管、離心管、培養(yǎng)皿等均購自Corning公司。

1.2.4 主要儀器 體視顯微系統(tǒng)（OLYMPUS SZX10）、倒置顯微系統(tǒng)（OLYMPUS IX71）、超凈工作臺（SW-CJ-2FD）和二氧化碳培養(yǎng)箱等（SANYO MCO-5AC）均由山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.2.5 培養(yǎng)液 采卵液：M199（含20 mmol/L Hepes，2%ESS，10 mg/mL 肝素鈉）；成熟液：M199（含 20%ESS，10 μg/mL FSH，10 μg/mL LH，1 μg/mL 17β-E2）；獲能液：合成輸卵管液（SOF）（含 20 μg/mL 肝素鈉）；受精液：SOF液（含 2%ESS）；受精卵發(fā)育液：SOF液（含 8 mg/mL BSA，2%EAA，1%NEAA）。

1.3 方法

1.3.1 凍精制作 將活力0.8以上的杜泊羊精液用常規(guī)干冰冷凍法制作顆粒凍精。

1.3.2 ESS制備 從發(fā)情羊的頸靜脈采集血液，4℃冰箱靜置20 h左右，吸取血清，56℃水浴滅活30 min，用0.22 μm濾器過濾后分裝，-20℃冷凍保存。

1.3.3 羔羊超數(shù)排卵 采用Kelly等［1］羔羊超數(shù)排卵方法，不同的是PMSG注射量每只320 U。

1.3.4 精子獲能 采用白佳樺［6］精子體外獲能方法。

1.3.5 采集卵母細胞 供體羔羊經(jīng)麻醉、固定、手術(shù)部位消毒后，用手術(shù)刀在乳房前腹部稍偏正中線處切3～5 cm小口，輕輕將卵巢牽到腹腔外，用吸有2 mL采卵液的10 mL注射器上的18＃針頭刺破卵巢上直徑2 mm以上的卵泡，吸出卵丘-卵母細胞復(fù)合體（COCs），采卵完畢，術(shù)口縫合與消毒。

1.3.6 卵母細胞成熟-受精-受精卵培養(yǎng) 將采集到的A、B級COCs放入四孔培養(yǎng)板孔中的成熟液里，礦物油覆蓋，在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中（38.5℃、飽和濕度）成熟培養(yǎng)24 h左右，以第一極體排出為卵母細胞成熟的評判標準。

將成熟的卵母細胞在0.2%透明質(zhì)酸酶的溶液中輕輕吹打除去部分卵丘細胞后，放入四孔培養(yǎng)板孔中的受精液里，加入獲能精子，濃度為每毫升 1×106～2×106個精子，覆蓋礦物油，在5%CO2培養(yǎng)箱中受精孵育24 h。

除去受精卵上附著的殘留精子和卵丘細胞后，放入四孔培養(yǎng)板孔中的受精卵發(fā)育液里，覆蓋礦物油。再將四孔板裝入鋁箔袋內(nèi)（充入5%CO2、7%氧氣、88%氮氣的混合氣體），封口。在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h左右，顯微鏡下觀察卵裂情況并統(tǒng)計卵裂率。

1.3.7 受體羊同期發(fā)情 受體羊陰道埋植CIDR 12 d，在撤出CIDR時每只受體羊肌肉注射PMSG 330 U。

1.3.8 受精卵移植 手術(shù)方法同前1.3.5，輕輕將卵巢有排卵點一側(cè)的卵巢和輸卵管牽到腹腔外，用移胚器吸4～5枚2～4細胞期受精卵植入輸卵管壺腹部。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

試驗數(shù)據(jù)采用Excel統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 促性腺激素誘導(dǎo)的效果

4～8周齡杜泊羊采集卵母細胞情況見表1，卵巢和卵泡發(fā)育情況見圖1。

由表1可知，促性腺激素誘導(dǎo)的8只4～8周齡杜泊羊，其中7只羊卵巢發(fā)育，超排反應(yīng)率87.50%。共獲得卵母細胞復(fù)合體（COCs）605 枚，平均 75.63 枚/只；A、B級卵母細胞復(fù)合體（COCs）585枚，平均73.13枚/只。

由圖1可知，對激素誘導(dǎo)有反應(yīng)的7只4～8周齡杜泊羊，卵巢體積增大、紅漲，上面布滿了發(fā)育卵泡。

表1 4～8周齡杜泊羊采集卵母細胞情況 枚/只

圖1 促性腺激素誘導(dǎo)后卵巢上卵泡

2.2 卵母細胞體外發(fā)育情況

將585枚可用卵母細胞（COCs）通過在體外成熟液里成熟培養(yǎng)，其中有439枚卵母細胞成熟，成熟率75.04%；將成熟卵母細胞與獲能精子共同孵育、受精卵培養(yǎng)后，有346枚受精卵分裂為2～4細胞，卵裂率59.15%，平均獲得2～4細胞期體外受精卵43.25枚/只。受精卵發(fā)育情況見圖2。

圖2 2～4細胞期體外受精卵

2.3 2～4細胞期受精卵移植的效果

將77枚2～4細胞期的體外受精卵移植于17只同期發(fā)情受體母羊的輸卵管壺腹部，每只母羊移植4～5枚受精卵。結(jié)果7只母羊懷孕，產(chǎn)羔13只，其中6只母羊產(chǎn)雙羔，1只母羊產(chǎn)單羔，受胎率41.18%，平均6枚2～4細胞期體外受精卵可生產(chǎn)1只JIVET（試管）羔羊，“試管羊”見圖3。

圖3 移植2～8細胞期體外受精卵生產(chǎn)的“試管羊”

3 討論

3.1 激素誘導(dǎo)方法對幼齡杜泊羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)體系的影響

用促性腺激素誘導(dǎo)幼齡杜泊羊卵巢上卵泡發(fā)育，并獲得大量的卵母細胞是建立幼齡杜泊羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)體系的基礎(chǔ)。在激素誘導(dǎo)幼齡羊的研究領(lǐng)域，Gou等［5］用FSH和PMSG誘導(dǎo)1月齡羔羊，獲得卵母細胞79.1 枚/只；Kelly 等［1，3］對每只 1～2 月齡羔羊注射 FSH 160 mg和PMSG 500 U進行了卵泡發(fā)育的研究，結(jié)果每只羔羊獲得卵母細胞80.0枚以上；武偉偉等［17］采用等量法和遞減法對每只30～60 d的新疆細毛羊羔羊注射120 U的FSH進行卵泡發(fā)育研究，結(jié)果表明，等量法獲得卵母細胞101.0枚/只，顯著高于遞減法（39.0枚/只）；于勇等［18］為研究1月齡和3月齡陶寒雜種羊的卵泡發(fā)育，采用2天4次等量法對每只羊注射FSH 160 mg，最后一次注射FSH時加注PMSG 500 U，結(jié)果表明，1月齡羔羊血液中FSH水平顯著高于3月齡羔羊，獲得卵母細胞79.0枚/只，顯著高于3月齡羔羊（18.5枚/只）。本試驗采用加拿大生產(chǎn)的FSH和寧波激素廠生產(chǎn)的PMSG誘導(dǎo)4～8周齡杜泊羊卵巢上的卵泡發(fā)育，2天4次（只均每次40 mg）間隔12 h注射FSH，最后一次注射FSH的同時每只羊注射PMSG 320 U，平均獲得卵母細胞復(fù)合體（COCs）75.63 枚/只。本研究結(jié)果與 Gou 等［5］、Kelly等［1，3］研究的 1～2 月齡羔羊結(jié)果基本一致，也與武偉偉等［17］、于勇等［18］采用的等量激素誘導(dǎo)法誘導(dǎo) 1 月齡陶寒雜種羊和30～60 d新疆細毛羊羔羊卵泡發(fā)育的研究結(jié)果一致。說明本試驗采用促性腺激素誘導(dǎo)4～8周齡杜泊羊的卵巢卵泡發(fā)育的方法可行。

3.2 卵母細胞體外成熟-受精-受精卵培養(yǎng)的方法對幼齡杜泊羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)體系的影響

幼齡羊卵母細胞體外成熟、受精孵育、受精卵培養(yǎng)等方法構(gòu)成幼齡羊胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)體系，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會影響幼齡羊胚胎體外生產(chǎn)的效果。在卵母細胞體外培養(yǎng)體系研究中，Bai等［4］在蒙古羔羊卵母細胞成熟液里添加600 μmol/L半胱氨酸和100 μmol/L β-巰基乙醇，受精率和囊胚率分別達86.9%和23.9%，顯著高于對照組的67.9%和14.9%（P＜0.05）；研究還發(fā)現(xiàn)，在成熟液里添加半胱氨酸和β-巰基乙醇，可以降低卵母細胞孤雌激活和多精子受精比例，加快受精卵發(fā)育到囊胚的速度。郭洪等［19］在4～8周齡綿羊卵母細胞體外成熟液里添加100 μmol/L β-巰基乙醇，結(jié)果表明，卵裂率（68.0%）高于對照組（64.2%），且囊胚率（19.3%）也顯著高于對照組（9.8%）（P＜0.05），表明 β-巰基乙醇能顯著提高羔羊卵母細胞的發(fā)育能力。汪立芹等［7］進行了薩?？烁嵫蚵涯讣毎w外發(fā)育的研究，結(jié)果表明，卵裂率73.93%。常迪等［20］進行了波爾山羊羔羊體外受精技術(shù)研究，發(fā)現(xiàn)CIDR+FSH組合超數(shù)排卵獲得卵母細胞卵裂效果好，卵裂率69.0%。本試驗采用常規(guī)卵母細胞體外受精培養(yǎng)體系和培養(yǎng)方法進行4～8周齡杜泊羊卵母細胞發(fā)育研究，成熟率75.04%，卵裂率59.15%，卵裂率稍低于 Bai等［4］、郭洪等［19］、汪立芹等［7］及常迪等［20］對幼齡蒙古羊、4～8周齡綿羊、幼齡薩福克羊及波爾山羊羔羊的研究結(jié)果。其原因可能是二氧化碳氣體純度影響了卵母細胞發(fā)育，使卵母細胞的成熟和卵裂有點滯后，導(dǎo)致卵母細胞成熟率及受精卵的卵裂率有所降低。

研究表明，本試驗采用的4～8周齡杜泊羊胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)方法可行，但仍需要進一步改進和提高。

3.3 2～4細胞期受精卵移植方法對幼齡杜泊羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)體系的影響

羊卵子受精在輸卵管壺腹部，受精卵發(fā)育到16細胞期是在輸卵管完成的。因此，2～4細胞期體外受精卵移植應(yīng)在輸卵管移植。汪立芹等［7］、郭洪等［8］、劉宗正等［9］、馬世科等［10］進行了薩?？搜颉⒐_克羊、陶賽特羊及小尾寒羊的JIVET技術(shù)研究，受胎率16.6%～53.6%。本試驗將2～4細胞期的體外受精卵移植于同期發(fā)情受體母羊的輸卵管壺腹部，受胎率41.18%，與上述研究者的研究結(jié)果相一致。表明本試驗采用的2～4細胞期受精卵移植方法可行。

4 結(jié)論

本試驗進行4～8周齡杜泊羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的研究，平均獲得A、B級卵母細胞73.13枚/只，2～4細胞期體外受精卵43.25枚/只，卵裂率59.15%，給17只受體母羊移植77枚2～4細胞期體外受精卵，7只受孕，生產(chǎn)13只“試管羊”，受胎率41.18%。結(jié)果表明，本試驗采用的激素誘導(dǎo)技術(shù)、卵母細胞體外成熟-受精-受精卵培養(yǎng)技術(shù)及2～4細胞期受精卵移植技術(shù)，可作為4～8周齡肉用綿羊胚胎體外生產(chǎn)的有效技術(shù)。

致謝：感謝國家絨毛用羊技術(shù)體系胚胎工程崗位專家安曉榮教授及團隊成員侯健、關(guān)宏、閻鳳祥、鄭立和王春昕等對本文試驗的支持。