白雅琴 ，劉艷文 ，趙名揚 ，秦紅林 ，王成強(qiáng) ，潘和平

（1.甘肅省畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)管理局，蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)，蘭州 730030）

甘肅省岷縣黑裘皮羊為著名地方優(yōu)良綿羊品種，又稱岷縣黑紫羔羊，屬山谷型藏羊，是優(yōu)秀的裘用羊種之一，同時也為人們提供優(yōu)質(zhì)的肉、乳、毛等產(chǎn)品。岷縣黑裘皮羊產(chǎn)地海拔一般為2 500～3 200 m，主要分布在甘肅武都地區(qū)的西北部，洮河中游，是甘肅甘南高原與隴南山地接壤區(qū)主要綿羊品種之一。該羊體質(zhì)細(xì)致，結(jié)構(gòu)緊湊。頭清秀，鼻梁隆起，公羊有角，向后向外呈螺旋狀彎曲，母羊多數(shù)無角，少數(shù)有小角；頸長適中，背平直，尾小呈錐形。體軀、四肢、頭、尾和蹄全呈黑色。

肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）是1997年發(fā)現(xiàn)的一類在骨骼肌中廣泛表達(dá)的糖蛋白，其編碼蛋白質(zhì)是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的一員，可阻礙肌細(xì)胞和肌纖維的生長。MSTN基因的缺失或降低會引起動物機(jī)體的肌肉過度發(fā)育［1］。作為一個骨骼肌生長負(fù)調(diào)節(jié)因子，MSTN還可能會影響瘦素的產(chǎn)生、分泌［2］，調(diào)控脂肪細(xì)胞分化［3］。Kambadur等研究發(fā)現(xiàn)，在相同飼養(yǎng)管理條件下，MSTN基因突變的雙肌牛比普通牛的產(chǎn)肉量明顯增加［4］。其他的研究也觀察到，MSTN 基因突變也會造成人［5］、狗［6］、豬［7］、羊［8-10］等呈現(xiàn)雙肌表型。為了深入探討岷縣黑裘皮羊MSTN基因的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能，本研究利用克隆、測序技術(shù)和生物信息學(xué)方法，對岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子的相關(guān)生物信息學(xué)特征進(jìn)行了預(yù)測和分析，同時構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，為揭示該基因理化性質(zhì)、功能信息及相關(guān)生理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

24份血樣，采自生長環(huán)境一致、健康狀況良好的岷縣黑裘皮羊（雌雄各半）。采用醫(yī)用采血管，自尾靜脈采血10 mL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與PCR擴(kuò)增 采用苯酚-氯仿抽提法［11］從凍存血樣中提取岷縣黑裘皮羊總基因組DNA，加去離子水溶解稀釋，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

依據(jù)GenBank中收錄的綿羊MSTN基因序列（NM_001009428），應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計引物對P1，交蘭州領(lǐng)先生物技術(shù)有限公司合成。上游引物序列為：5′-CGTTTGGCTTGGCGTTACTC-3′，下游引物序列為：5′-GAAGATCAGACTCCGTGGGC-3′；預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物大小為468 bp。PCR擴(kuò)增體系總體積為20 μL：DNA模板0.5μL，上下游引物各 0.3μL，2×TaqPCRMasterMix10μL，無菌水 8.9 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，51.4℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，30 個循環(huán)；72℃延伸3 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用T載體克隆，經(jīng)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序后，得到其目的片段基因序列。

1.2.2 岷縣黑裘皮羊MSTN基因P1引物擴(kuò)增結(jié)果 岷縣黑裘皮羊MSTN基因PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，可見擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，片段大小與預(yù)期擴(kuò)增片段相符。

圖1 岷縣黑裘皮羊MSTN基因P1引物的瓊脂糖檢測

1.3 生物信息學(xué)預(yù)測和分析

對岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼產(chǎn)物的氨基酸序列、蛋白質(zhì)特性及功能結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析與預(yù)測所用各種網(wǎng)址與工具軟件見表1。

表1 岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子生物信息學(xué)主要分析軟件[12]

2 結(jié)果與分析

2.1 編碼氨基酸理化性質(zhì)的預(yù)測和分析

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)氨基酸脫水縮合形成的多肽鏈，其基本性質(zhì)包括氨基酸組成、相對分子質(zhì)量、半衰期等。利用在線軟件http：//web.expasy.org/protparam/進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼69個氨基酸，20種氨基酸所占比例見表3，其中亮氨酸（Leu）數(shù)目最多，占整個氨基酸組成的13.0%，不存在色氨酸（Trp），編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定系數(shù)大于40，表明該基因編碼產(chǎn)物不穩(wěn)定［13］。

2.2 編碼蛋白質(zhì)疏水性/親水性預(yù)測與分析

利用在線軟件 http：//web.expasy.org/protscale/對岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼氨基酸序列親水性/疏水性進(jìn)行分析和預(yù)測，結(jié)果如圖2所示。其中第31位異亮氨酸（Ile）的疏水性最強(qiáng)（+4.500）；第50位的精氨酸（Arg）的親水性最強(qiáng)（-4.500）。整條氨基酸肽鏈中，親水氨基酸占65.00%，疏水氨基酸占35.00%，總平均親水性為-0.49，表現(xiàn)為親水性，因此，可推斷岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼的蛋白質(zhì)是一種可溶性蛋白。

2.3 編碼蛋白質(zhì)N-糖基化位點預(yù)測和分析

蛋白質(zhì)糖基化是真核生物蛋白質(zhì)翻譯后加工的重要修飾之一，蛋白質(zhì)糖基化修飾對蛋白質(zhì)折疊、分選及其定位有重要影響，使用在線軟件http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/對MSTN基因特定片段N-糖基化位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖3所示。岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼氨基酸不存在N-糖基化位點。

表2 岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼蛋白質(zhì)理化特征

表3 岷縣黑裘皮羊MSTN第一外顯子編碼蛋白的氨基酸組成%

2.4 編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和全蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指依靠不同氨基酸之間的C=OH和N-H基團(tuán)間的氫鍵形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)（主要為α-螺旋和β-折疊），蛋白質(zhì)多肽鏈在各種二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再進(jìn)一步盤區(qū)或折疊，形成具有一定規(guī)律的三維結(jié)構(gòu)，即三級結(jié)構(gòu)。岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果（圖4）顯示，α-螺旋（Hh）占36.23%，β-折疊（Ee）占 18.84%，β-轉(zhuǎn)角（Tt）占8.70%，無規(guī)則卷曲（Cc）占36.32%。肌肉生長抑制素二級結(jié)構(gòu)中，Cc占主導(dǎo)地位。綿羊MSTN基因編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)見圖5，從預(yù)測結(jié)果來看，其三級結(jié)構(gòu)主要成分為無規(guī)則卷曲（Cc），與岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼產(chǎn)物二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果一致。

圖2 岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼蛋白質(zhì)的疏水性預(yù)測結(jié)果

圖3 岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼蛋白質(zhì)N-糖基位點預(yù)測

圖4 岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5 編碼蛋白質(zhì)信號肽分析

信號肽位于蛋白質(zhì)N-端，一般由16～26個氨基酸殘基組成［14］，是決定新生肽鏈在細(xì)胞中的定位或決定某些氨基酸殘基修飾的一些肽段。信號肽可使正在翻譯的核糖體附著到RER膜上，并指引蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運輸。在線軟件 http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析結(jié)果顯示（圖6），岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼產(chǎn)物C值0.170，Y值0.225，S值0.339，其切割點最有可能位于39～40位的氨基酸間，基本可以判定岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼產(chǎn)物存在信號肽。

圖6 岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼蛋白質(zhì)信號肽分析

2.6 綿羊MSTN基因編碼蛋白的同源序列分析

對9個物種的MSTN基因編碼產(chǎn)物序列進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7）。由分析結(jié)果可知，MSTN基因幾乎在所有的哺乳動物中都有表達(dá)。從進(jìn)化樹分析結(jié)果來看，進(jìn)化樹分為兩大支，其中斑馬魚為獨立的一支。從另一支中可以發(fā)現(xiàn)，綿羊MSTN基因的親緣關(guān)系與牛最近，分子進(jìn)化距離最近。

圖7 綿羊MSTN基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

許多研究表明，MSTN基因編碼的肌肉生長抑制素能調(diào)控骨骼肌的發(fā)育，其活性的喪失或降低，會引起動物肌肉的過度發(fā)育，肉質(zhì)下降，出現(xiàn)雙肌性狀。比利時藍(lán)白花奶牛中MSTN基因缺失某些片段，導(dǎo)致該基因閱讀框架發(fā)生改變，分子活性區(qū)域消失，出現(xiàn)雙肌比利時牛；皮埃蒙特牛的MSTN基因外顯子1中某位點C變成A，外顯子3中某位點G變成A，從而導(dǎo)致雙肌牛［15］。因此，對MSTN基因第一外顯子的生物信息學(xué)分析可間接對畜禽生產(chǎn)實際及經(jīng)濟(jì)價值利用有一定的指導(dǎo)作用。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定其功能特點，進(jìn)而影響其生命活動的代謝。岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼69個氨基酸，編碼產(chǎn)物為不穩(wěn)定的可溶性蛋白質(zhì)。研究表明，蛋白質(zhì)半衰期與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性成正比［16］。而本研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因第一外顯子編碼產(chǎn)物氨基酸具有較長的半衰期（20 h）卻是不穩(wěn)定蛋白，出現(xiàn)這一特性的原因可能與其不同生理功能的發(fā)揮存在某種聯(lián)系，即可能是岷縣黑裘皮羊的整個CDS區(qū)序列編碼產(chǎn)物也具有相同的特性。N-糖基化是真核生物蛋白質(zhì)翻譯后重要的修飾之一，N-糖基化主要包括N-糖的合成、轉(zhuǎn)移和修飾3個過程。N-糖的合成和轉(zhuǎn)移在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行，其修飾過程在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中都存在。它可以影響蛋白質(zhì)的抗原決定簇、電荷性質(zhì)、熱穩(wěn)定性、最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能，從而產(chǎn)生不同的表達(dá)效果，還可以調(diào)控蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞中的定位、功能和活性［17］，糖基化位點發(fā)生變化可能與疾病的發(fā)生有關(guān)［18］。而本研究中岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼蛋白上不存在糖基化位點，在此結(jié)果上就可以進(jìn)一步推斷岷縣黑裘皮羊MSTN基因CDS區(qū)序列編碼蛋白是否存在糖基化位點。據(jù)相關(guān)報道，無規(guī)則卷曲易受側(cè)鏈相互影響而改變空間構(gòu)象，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)多肽鏈中構(gòu)成配體受體結(jié)合的活性部位［19］，MSTM基因第一外顯子編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中大量的無規(guī)則卷曲可能影響蛋白質(zhì)多肽鏈的結(jié)合活性，從而影響蛋白質(zhì)的功能。而肌肉生長抑制素很可能是通過自分泌機(jī)制調(diào)控肌肉生長性分化［20］，進(jìn)而抑制肌肉細(xì)胞前體增殖而發(fā)揮其功能［21］。這說明肌肉生長抑制素的作用機(jī)制與其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)存在著緊密的關(guān)系。另外，綿羊MSTN基因編碼產(chǎn)物的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果和岷縣黑裘皮羊MSTN基因第一外顯子編碼產(chǎn)物相似，均是以無規(guī)則卷曲為主，表明岷縣黑裘皮羊MSTN基因CDS區(qū)編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)應(yīng)該也都是以無規(guī)則卷曲為主。從氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，綿羊MSTN基因氨基酸序列與牛的同源性最高，其次為家馬，由此可推測，相對于其他動物，岷縣黑裘皮羊（綿羊）MSTN基因氨基酸序列和牛的同源性更高的概率較大。