采復(fù)拉·大木拉 ，田志龍 ，儲(chǔ)明星

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，烏魯木齊 830000；3.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽(yáng) 471003）

抑制素（Inhibin，INH）是由綿羊卵巢顆粒細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞分泌的糖蛋白質(zhì)激素，由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基通過(guò)二硫鍵構(gòu)成，其中抑制素α亞基（Inhibin α，INHA）是抑制素發(fā)揮生理功能必不可少的。INHA基因主要在動(dòng)物卵巢、睪丸中表達(dá)，后期研究者在動(dòng)物腎臟、垂體、肌肉中檢測(cè)到抑制素蛋白，其通過(guò)特異性抑制垂體促卵泡素分泌來(lái)調(diào)節(jié)卵泡的生成和抑制精子發(fā)生，從而降低睪丸的生精能力［1］。綿羊INHA基因已被定位到 2 號(hào)染色體上［2］。Shelling 等［3］的研究結(jié)果表明，INHA基因與女性卵巢早衰顯著相關(guān)；劉晨等［4］研究發(fā)現(xiàn)，INHA基因5'UTR區(qū)的多態(tài)性對(duì)豬繁殖性狀有顯著影響。Jaeger 等［5］和 Hiendleder等［6］研究發(fā)現(xiàn)，INHA基因?qū)d羊產(chǎn)羔數(shù)有顯著效應(yīng)。目前，INHA基因在人、牛、羊、小鼠和大鼠等雌性中研究較多，但關(guān)于該基因在公綿羊繁殖相關(guān)組織中的研究鮮有報(bào)道。

小尾寒羊平均產(chǎn)羔率267%，是我國(guó)高繁殖性能綿羊品種之一；蘇尼特羊是在自然選擇與人工選育過(guò)程中形成的地方優(yōu)良品種，平均產(chǎn)羔率113%［7］。本研究采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)INHA基因在高繁殖力小尾寒羊公羊和低繁殖力蘇尼特羊公羊下丘腦-垂體-睪丸軸等繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)，以探索INHA基因與公綿羊繁殖生理功能之間的關(guān)系，為深入理解公綿羊繁殖機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和主要試劑

小尾寒羊來(lái)自山東省鄆城縣大鵬農(nóng)牧科技有限公司，蘇尼特羊來(lái)自內(nèi)蒙古烏拉特中旗。從每個(gè)品種中分別挑選性成熟（8月齡以上）且健康狀況良好的純種公羊各3只。屠宰后分別采集大腦、小腦、下丘腦、垂體、輸精管、腎上腺、睪丸和附睪等組織，立即置于液氮中暫時(shí)保存，樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后全部轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司（北京），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit）和熒光定量染料（SYBR Premix Ex TaqTMⅡ）均購(gòu)于TaKaRa公司（大連）；2×Taq PCR Master Mix購(gòu)于拓英坊科技有限公司（北京）。

1.2 組織總RNA的提取和檢測(cè)

采用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（天根，北京）加Trizol（Invitrogen，美國(guó)）提取各組織總RNA。使用Nano Drop2000檢測(cè)提取RNA的純度和濃度，并使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank提供的綿羊INHA基因序列（登錄號(hào)：NM_001308579.1），利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行跨外顯子引物設(shè)計(jì)，以RPL19（登錄號(hào)：XM_015089125.1）作為內(nèi)參基因。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物具體信息見表1。

表1 綿羊INHA和RPL19基因的引物信息

1.4 cDNA合成

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系總體積為20 μL，需要量組成見表2。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃15 min，85℃5 s，獲得cDNA第一鏈。全程操作在冰上進(jìn)行。使用內(nèi)參基因RPL19對(duì)反轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，將符合標(biāo)準(zhǔn)的cDNA置于-20℃保存，以用于檢測(cè)目的基因的表達(dá)。

表2 反轉(zhuǎn)錄體系

1.5 PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，需要量組成見表3。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5 min；4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小。

表3 PCR體系 μL

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

1.6.1 qPCR體系和程序 反應(yīng)體系總體積為20 μL，需要量組成見表4。PCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 s，95℃變性5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后對(duì)熔解曲線進(jìn)行分析。

表4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系 μL

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)與數(shù)據(jù)分析 熒光定量檢測(cè)利用Roche Light Cycler480Ⅱ型熒光定量PCR儀進(jìn)行，以RPL19為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。采用2-△△Ct法［8］計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用一般線性模型及最小顯著差異（Least significant difference，LSD）法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與cDNA合成

利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA完整性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，RNA完整性良好，28 S條帶亮度大于18 S，且二者均無(wú)明顯降解（圖1A）；以反轉(zhuǎn)錄之后的cDNA為模板對(duì)INHA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)的INHA引物擴(kuò)增效果良好（圖1B），目的片段與預(yù)期的一致，且條帶單一，可以用于后續(xù)的熒光定量試驗(yàn)。

圖1 8個(gè)組織RNA電泳檢測(cè)及目的基因擴(kuò)增

2.2 INHA基因在不同品種公羊繁殖相關(guān)組織中的表達(dá)

運(yùn)用qPCR對(duì)小尾寒羊公羊和蘇尼特羊公羊的8個(gè)繁殖相關(guān)組織中INHA基因的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖2。2個(gè)品種比較發(fā)現(xiàn)，INHA基因在2個(gè)綿羊品種中的表達(dá)呈現(xiàn)出組織特異性。其中，INHA基因在睪丸和腎上腺組織中高表達(dá)，在睪丸中表達(dá)量最高，其次是腎上腺、附睪，在其他組織中均呈痕量表達(dá)；INHA基因在蘇尼特羊睪丸的表達(dá)量極顯著高于小尾寒羊（P＜0.01），在腎上腺的表達(dá)量高于小尾寒羊，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 INHA基因在公羊組織中的表達(dá)水平

3 討論

公畜體內(nèi)抑制素低水平表達(dá)可以促進(jìn)精子的生成，提高生精量，從而增強(qiáng)公畜的繁殖能力。目前降低抑制素水平的主要方法之一是通過(guò)免疫INHA和RNAi抑制INHA基因表達(dá)，而INHA啟動(dòng)子的過(guò)甲基化與前列腺癌的發(fā)生［9-10］以及INHA啟動(dòng)子多態(tài)性與卵巢早衰的關(guān)系［11-12］都受到廣泛的關(guān)注。

Voge等［13］通過(guò)主動(dòng)免疫公綿羊的抑制素α亞基來(lái)測(cè)定公綿羊血液中促卵泡素、睪丸重量、生精量、睪酮和促黃體素水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制素α通過(guò)改變曲細(xì)精管在睪丸中的比例來(lái)提高精子產(chǎn)量。該研究小組同時(shí)發(fā)現(xiàn)，抑制素的降低能促進(jìn)促黃體素對(duì)間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌睪酮（T）的作用，而睪酮在精子發(fā)生過(guò)程中具有十分重要的調(diào)控作用，是維持精子發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。蔡開來(lái)［14］研究發(fā)現(xiàn)，在精子第一波生成的過(guò)程中，從第1天至第21天，INHA基因mRNA的表達(dá)量高于同時(shí)期的INHβ-A和INHβ-B mRNA的表達(dá)量，而且從第28天開始至小鼠精子完全形成及以后的性成熟時(shí)期，INHA、INHβ-A和INHβ-B mRNA都維持在一個(gè)較低的表達(dá)水平，且INHA的蛋白水平在第28天之前表達(dá)量較高，之后顯著下降，并穩(wěn)定表達(dá)在一個(gè)較低的水平。動(dòng)物體促卵泡素、睪酮、促黃體素等共同構(gòu)成精子發(fā)生的微環(huán)境，若精子發(fā)生過(guò)程中微環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡被打破，直接影響精母細(xì)胞的形態(tài)，正常精子比率大大減少。睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞功能是精子發(fā)生的基礎(chǔ)，若抑制素或者睪酮分泌異常，便會(huì)影響睪丸生精作用的內(nèi)分泌環(huán)境，從而影響生育力。本研究中INHA基因在蘇尼特公羊睪丸中的表達(dá)量極顯著高于小尾寒羊（P＜0.01），在腎上腺中的表達(dá)量也比小尾寒羊高，但其表達(dá)差異并不顯著（P＞0.05），此結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，INHA在小尾寒羊和蘇尼特公羊睪丸中表達(dá)量最高，其次是腎上腺、附睪，在其他組織中均呈痕量表達(dá)。INHA基因在蘇尼特羊睪丸中的表達(dá)量極顯著高于小尾寒羊。暗示INHA基因可能主要在睪丸中對(duì)公綿羊繁殖功能發(fā)揮抑制作用。