王素貞,黃占旺,黃永平,陳佳妮

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330045)

高脂血癥是由各種原因?qū)е聶C(jī)體內(nèi)脂肪代謝的不平衡甚至是紊亂造成的,與心血管疾病、糖尿病、動脈粥樣硬化和肥胖等密切相關(guān)[1-2]。目前國內(nèi)外用于治療高脂血癥的藥物主要有他汀類[3]、貝特類[4]、煙酸[5]和膽汁酸多價(jià)螯合劑[6],已被證明具有確切的降脂作用。然而,因?yàn)殚L期使用這類藥物造成的肝腎毒性[7]、橫紋肌溶解[8]和高血糖[9]等副作用,有些患者對其不耐受,所以近年來預(yù)防和治療血脂異常具有輔助降血脂作用的保健食品得到了明顯的關(guān)注。

納豆凍干粉中含有納豆激酶、異黃酮、超氧化物歧化酶、維生素等活性物質(zhì),具有抗氧化、溶血栓、抗腫瘤等生物功能。研究[10-12]發(fā)現(xiàn)納豆凍干粉能夠降低膽固醇和甘油三酯水平,可用于預(yù)防與治療心血管疾病。紅曲粉中有效的降脂活性成分為莫奈可林K,其能夠抑制TC的合成,降低TC水平和提高HDL-C水平[13-14]。充分發(fā)掘兩者組合配方的降脂效果,對于開發(fā)功能性保健食品具有重要的現(xiàn)實(shí)意義,但各組合配制濃度對小鼠的降脂活性作用尚未見報(bào)道。因此,本文以高脂肪飲食誘導(dǎo)的高脂小鼠為模型,探討納豆凍干粉和紅曲粉組合對小鼠的降脂效果,有助于開發(fā)調(diào)節(jié)高脂血癥的健康食品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆凍干粉 2×1011CFU/g,實(shí)驗(yàn)室自制;紅曲粉 福建購買的紅曲米經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎;KM小鼠 清潔級,雌性,25～30 g,許可證號(SCXK(湘)2016-0002),湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司;滅菌動物飼料 許可證號(SCXK(湘)2014-0002),湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司;精制豬油 河南眾品食業(yè)股份有限公司;膽固醇、脫氧膽酸鈉 北京索萊寶科技有限公司;甲基硫氧嘧啶 阿拉丁(上海)試劑公司;丙二醇、吐溫-80 西隴化工股份有限公司;血清膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、高密度蛋白-膽固醇(HDL-C)試劑盒 南京建成生物有限公司;蛋白質(zhì)質(zhì)量測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司。

AUY120型電子天平 日本SHIMADZU公司;TGL-20000-cR離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國Thermo electron公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪乳劑的制備 稱取25.00 g豬油、10.00 g膽固醇、1.00 g甲基硫氧嘧啶于200 mL的燒杯中,加熱攪拌混勻加入25.0 mL吐溫-80,混勻后制成油相;另精確稱取2.00 g脫氧膽酸鈉于另一100 mL燒杯中,加入20.0 mL 1,2-丙二醇和60.0 mL蒸餾水,將其置于電爐上攪拌加熱至完全溶解,此時(shí)制成另一相—水相。放冷至一定溫度后將制備好的水相邊攪拌邊加入到油相中,充分?jǐn)嚢杈鶆蛑寥榘咨?即得到脂肪乳劑,封口密閉放置-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將體重為25～30 g成年的KM小鼠統(tǒng)一在溫度22～25 ℃、濕度40%～60%、光照比50%的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)3d,按體重隨機(jī)均衡分為8組,每組10只。動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組和受試物的分配情況如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組與受試物Table 1 The experimental groups and test sample

1.2.3 高脂模型建立與小鼠灌胃 除對照組外,其余小鼠組每天上午均灌胃給予0.2 mL/10 g的脂肪乳劑,按照上述表1每天下午對小鼠灌胃20 mL/kg BW的受試物或者溶劑(生理鹽水),每天按此法持續(xù)灌胃30 d。

1.2.4 檢測指標(biāo)

1.2.4.1 形態(tài)觀察與體重變化 觀察灌胃期小鼠的精神狀態(tài)、活動情況、體重、體毛、飲食等;每兩天稱重,記錄小鼠實(shí)驗(yàn)期間體重變化并同時(shí)測定小鼠的攝食量。

1.2.4.2 器官指數(shù) 小鼠末次灌胃后禁食18 h,自由飲水,稱重,乙醚處理后心室穿刺取血,4 ℃下2000 r/min離心15 min分離血清,分裝冷凍保存?zhèn)溆?。對小鼠進(jìn)行解剖,肉眼觀察小鼠體內(nèi)脂肪沉積情況及臟器變化情況,取肝臟和體脂(腎和性腺周圍脂肪墊組織),無菌生理鹽水沖洗后吸干水分快速稱重,計(jì)算肝體比、脂肪系數(shù)。其計(jì)算公式為:

體脂(g)=腎周圍脂肪+性腺周圍脂肪

肝體比(%)=肝臟重量/體重×100

脂肪系數(shù)(%)=脂肪總重/體重×100

1.2.4.3 血清各指數(shù)測定 將1.2.4.2保存的血清參照試劑盒說明書進(jìn)行TC、TG、HDL-C含量的測定。計(jì)算動脈粥樣硬化指數(shù)AI=(TC-HDL-C)/HDL-C。

1.2.4.4 肝臟中TC、TG含量的測定 用0.9%生理鹽水將肝臟制備成組織勻漿,參照試劑盒說明書測定其小鼠肝臟TC、TG水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析,統(tǒng)計(jì)計(jì)算結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,并用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行均值多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 日?；顒訝顩r

實(shí)驗(yàn)期間,各組小鼠精神狀況良好,無腹瀉、便血等異常疾病的發(fā)生,皮毛光潔、緊貼于體表,行動反應(yīng)迅速敏捷;生長狀態(tài)良好,除空白對照組外,其余各組的小鼠體型上要稍大些。

2.2 小鼠體重變化

由表2可見,與對照組相比,其余各組小鼠體重增長有顯著性差異(p<0.05),說明高脂血癥小鼠在體重增長上快于正常小鼠,因脂肪乳劑的營養(yǎng)高于其他物質(zhì);與高脂模型組相比,各藥物劑量組小鼠的體重增長無顯著性差異(p>0.05),說明各受試物對小鼠體重的增長無影響。

表2 受試物對小鼠體重的影響Table 2 Effects of test sample on weight of

2.3 對小鼠肝體比、體脂、脂肪系數(shù)的影響

肝體比反映各受試物對小鼠肝臟的損害程度,體脂與脂肪系數(shù)聯(lián)合反映了高脂飲食和受試物對小鼠脂肪堆積程度的影響。由表3可知，從肝體比上看,各組均無顯著性差異,但納豆粉組、紅曲粉組和復(fù)合物組1～4均稍低于高脂模型組,稍微緩解小鼠肝臟腫大程度。

表3 受試物對肝體比、體脂和脂肪系數(shù)的影響Table 3 Effects of test sample on liver coefficient,fat weight and coefficient of

在小鼠體脂重量相比下,各組的體脂均極顯著高于對照組小鼠(p<0.01),表明脂肪乳劑能夠增加小鼠的體內(nèi)脂肪,造模成功;與高脂模型組相比,復(fù)合物組4顯著性降低(p<0.05),表明高劑量的納豆粉和紅曲粉能夠降低高脂小鼠的體內(nèi)脂肪。

從脂肪系數(shù)上看,各組與對照組相比均具有極顯著性(p<0.01),明顯高于正常小鼠的脂肪系數(shù);與模型組相比,紅曲粉組和復(fù)合物組3均顯著低于高脂模型小鼠的脂肪系數(shù)(p<0.05),復(fù)合物組4極顯著性低于高脂模型小鼠的脂肪系數(shù)(p<0.01);而與紅曲粉組相比,復(fù)合物組4極顯著性低于紅曲粉組的脂肪系數(shù)(p<0.01)。

2.4 血清各指數(shù)水平

由表4可知，與對照組相比,高脂模型組小鼠的血清TC、HDL-C具有極顯著性差異(p<0.01),血清TG具有顯著性差異(p<0.05),TC和TG均有所增加,HDL-C則降低,表明脂肪乳劑能夠調(diào)節(jié)小鼠血清的脂質(zhì)水平,達(dá)到高脂狀態(tài),即造模成功。

表4 受試物對小鼠血清TC、TG、HDL-C和AI的影響Table 4 Effects of test sample on TC,TG,HDL-C,AI of mice

從TC水平上看,灌胃受試物后,紅曲粉組、復(fù)合物組2、復(fù)合物組3、復(fù)合物組4均要極顯著性地低于高脂模型組小鼠(p<0.01);與紅曲粉組相比,復(fù)合物組4顯著性地降低(p<0.05),表明不同濃度的納豆粉和紅曲粉在降低小鼠TC水平上發(fā)揮作用。

從TG水平上看,紅曲粉組、復(fù)合物組2、復(fù)合物組4顯著性地低于高脂模型組小鼠(p<0.05);而且與納豆粉組相比,復(fù)合物組4的TG水平顯著性降低(p<0.05);說明紅曲粉、納豆粉和紅曲粉組合能夠降低小鼠TG水平。

從HDL-C水平看,紅曲粉組、復(fù)合物組2、復(fù)合物組4均要極顯著性地高于高脂模型組小鼠(p<0.01);與納豆粉組相比,紅曲粉組、復(fù)合物組2、復(fù)合物組4均極顯著性升高(p<0.01);說明紅曲粉對提高小鼠HDL-C水平有顯著效果。

而且,高脂模型組小鼠的AI值與對照組相比具有極顯著性(p<0.01),高出幾倍,說明灌胃脂肪乳劑可以顯著性地增加小鼠患動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的概率;納豆粉組與復(fù)合物組1與高脂模型組小鼠相比,AI值無顯著性差異,而其余各組小鼠的AI值均顯著性降低,表明納豆粉和紅曲粉組合能夠減少其疾病的發(fā)生概率。

2.5 對小鼠肝臟脂質(zhì)的影響

由表5可知，高脂模型組小鼠肝臟的TC、TG水平均極顯著高于對照組小鼠(p<0.01),顯示出脂肪乳劑也能夠使得小鼠的肝臟脂質(zhì)水平發(fā)生變化,高脂模型造模成功;紅曲粉組、復(fù)合物組2、復(fù)合物組4小鼠的TC水平均顯著低于高脂模型組小鼠的水平(p<0.05);復(fù)合物組4的TG水平顯著低于高脂模型組小鼠的水平(p<0.05)。這表明納豆粉和紅曲粉以適當(dāng)比例的組合可以輔助降低小鼠肝臟TC、TG水平,發(fā)揮降脂作用。

表5 受試物對小鼠肝臟TC和TG的影響Table 5 Effects of test sample on TC and TG level of

3 討論

高脂血癥尤其是血清總膽固醇升高是引起心血管疾病的危險(xiǎn)因素,全世界每年估計(jì)造成440萬人的死亡[15]。高脂血癥狀態(tài)是建立在以前有相似實(shí)驗(yàn)研究模型之上的[16-18]。這些研究是在體重為25～30 g雌性昆明小鼠中進(jìn)行的,并且給予高脂飲食一個(gè)月。在這些研究中,正常飲食小鼠平均血清總膽固醇水平為1～2 mmol/L,高脂小鼠血清總膽固醇水平為2～3 mmol/L。這與我們研究中高脂模型組小鼠血清膽固醇水平(2.557±0.169) mmol/L一致。

有相當(dāng)數(shù)量的人口、動物研究報(bào)道了紅曲米的降脂作用,而且?guī)讉€(gè)世紀(jì)以來已經(jīng)在我國被用作膳食補(bǔ)充劑和草藥的紅曲米作為治療高脂血癥的藥物[19]。紅曲米的成分包括莫納可林(洛伐他汀)等被認(rèn)為在高脂血癥的治療中發(fā)揮重要作用[20]。臨床研究表明,紅曲米有將血清LDL-C水平降低10%～33%的可能[21-22]。雙盲隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)顯示,與安慰劑相比,紅曲米或其提取物可降低總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平[23-24]。一項(xiàng)隨機(jī)對照動物實(shí)驗(yàn)表明,紅曲米可防止喂食高脂肪飲食的小鼠發(fā)生肥胖、高脂血癥和脂肪肝[25]。因此,紅曲米不僅具有治療潛力,而且具有預(yù)防高脂血癥和肥胖癥的潛力。動物研究表明,紅曲米提取物在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭心軌蚪档椭|(zhì)過氧化水平。印度品種紅曲米水提取物的使用降低了脂質(zhì)過氧化水平,并增加依賴于高膽固醇飲食喂養(yǎng)鏈脲霉素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的還原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶劑量的水平[26]。實(shí)驗(yàn)性動脈粥樣硬化兔模型中,紅曲米能夠降低血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和血液丙二醛水平[27]。在使用紅曲米的許多動物與人體實(shí)驗(yàn)研究顯示,膽固醇和甘油三脂水平一致下降。

謝嵩等[28]研究了不同劑量的納豆激酶凍干粉對高脂模型大鼠的降脂功能,測定了大鼠的血清TC、TG水平,發(fā)現(xiàn)各劑量的納豆激酶凍干粉均能顯著地降低TC、TG水平,其表明納豆激酶具有降脂作用。袁淑云等[29]通過自由進(jìn)食高脂飼料造成的高脂小鼠模型,探究納豆激酶提取液對小鼠血清TC、HDL-C和AI的影響,結(jié)果表明納豆激酶提取液具有預(yù)防與降脂作用。張瑩等[30]通過測定家兔血清額TC、TG、LDL-C、HDL-C水平得到納豆激酶對家兔的脂質(zhì)異常具有顯著的調(diào)節(jié)和改善作用。段智變等[31]發(fā)現(xiàn)納豆提取物能夠降低LDL-C含量而提高HDL-C的含量,使得血清中的血脂水平降低,達(dá)到治療效果。各研究表明納豆凍干粉具有降低小鼠、大鼠和家兔血清TC、TG水平的作用。

納豆凍干粉中的異黃酮能夠使LDL受體發(fā)生正向調(diào)節(jié),使LDL受體增加,從而影響血液膽固醇水平[32-33]。納豆凍干粉的有效成分納豆激酶對降低血脂功能起主要作用。納豆激酶參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié),通過其對涉及脂質(zhì)代謝的某些蛋白質(zhì)靶標(biāo)的蛋白水解活性。由于酶是反應(yīng)的生物催化劑,如果在反應(yīng)中相關(guān)酶失活,任何代謝反應(yīng)都會受到不同程度的影響。紅曲粉的有效成分莫奈可林K抑制HMG-CoA還原酶,使其活性降低,對降低膽固醇水平具有有效作用[34]。因此,兩者組合時(shí)在降低血脂功能上能夠起到相互促進(jìn)作用,相輔相成,從而達(dá)到更佳的作用效果。

與這些研究相一致,我們預(yù)計(jì)與高脂模型組相比,所有實(shí)驗(yàn)組的脂質(zhì)水平都下降。但發(fā)現(xiàn)與紅曲粉組相比,只有高劑量組顯示出較低的脂質(zhì)水平。這些數(shù)據(jù)結(jié)果表明,紅曲粉、納豆粉均具有降脂作用,而且高劑量的紅曲粉和納豆粉在降脂作用上具有協(xié)同作用,共同輔助降脂。

4 結(jié)論

通過脂肪乳劑灌胃小鼠,建立高脂小鼠模型。在高脂小鼠基礎(chǔ)上對納豆粉和紅曲粉的降脂功能進(jìn)行探究,獲得適當(dāng)比例的復(fù)合物對小鼠的降脂活性指標(biāo),從而為開發(fā)納豆粉與紅曲粉復(fù)合物保健品提供研究基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本文結(jié)果表明納豆粉和紅曲粉組合在適當(dāng)比例下比單獨(dú)使用納豆粉、紅曲粉在降低小鼠脂質(zhì)水平上具有更明顯效果。其對小鼠的體重增量無影響;與高脂模型組相比,高劑量(200 mg/mL)納豆粉和中劑量(100 mg/mL)紅曲粉組合的體內(nèi)脂肪顯著地低于高脂模型組水平(p<0.05);與高脂模型組相比,納豆粉與紅曲粉組合能夠降低高脂小鼠血清TC、TG 水平,提高HDL-C水平。納豆粉與紅曲粉組合可以輔助降低小鼠肝臟TC、TG水平,發(fā)揮降脂作用。綜上結(jié)果可知,納豆粉與紅曲粉兩者相輔相成、取長補(bǔ)短,以適當(dāng)比例組合在降低小鼠血脂方面能夠發(fā)揮更加顯著效果,用于預(yù)防血脂異常、心血管疾病、動脈粥樣硬化等疾病。