曹 江,翟齊嘯,徐 斐,*

(1.上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院,上海 200093;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是一種極具潛力的芽孢益生菌,早在2012年,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)就批準凝結芽孢桿菌為一種安全可食用菌株。2016年,中國衛(wèi)生計生委發(fā)布的《可用于食品的菌種名單》中,凝結芽孢桿菌也位列其中。目前,凝結芽孢桿菌已廣泛應用于畜牧及水產(chǎn)行業(yè),可顯著提高飼料品質,降低料重比,促進動物成長。然而,在人體益生調節(jié)方面,凝結芽孢桿菌在國內仍處于起步階段。本文結合國內外學者的研究,簡述了凝結芽孢桿菌的微生物特性研究,并分析了該菌對宿主腸道健康的影響。

1 凝結芽孢桿菌的微生物特性

凝結芽孢桿菌在自然界中分布范圍廣泛,在熱帶地區(qū)的河流、污水、土壤、蔬菜中均有所分布,可在酸性食物,像番茄汁罐頭和青貯飼料中繁殖[1]。凝結芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌,屬厚壁菌門芽孢桿菌科芽孢桿菌屬,兼性厭氧菌,菌落為不透明白色圓形,菌體呈桿狀,長約2.5～5 μm,寬約0.6～1 μm,兩端鈍圓,端生芽孢,無鞭毛[2]。該菌的生長條件較為寬松,其最低營養(yǎng)條件隨著菌株和培養(yǎng)溫度而變化,最適生長溫度為37～45 ℃,最適pH接近6,不同菌株中生長的最低pH為4.0～5.0[1]。在生長過程中,凝結芽孢桿菌可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇等多種糖類生成L-乳酸,為同型乳酸發(fā)酵。此外,研究發(fā)現(xiàn),生物素和硫胺素是促進凝結芽孢桿菌生長的主要生長因子[3]。

相比乳桿菌、雙歧桿菌等益生菌,凝結芽孢桿菌因其產(chǎn)芽孢的特性,在食品加工和儲存中有著得天獨厚的優(yōu)勢。凝結芽孢桿菌BC-HY1的芽孢在100 ℃處理30 min后,芽孢存活率達52.3%[4]。芽孢所特有的耐熱性和穩(wěn)定性極大的豐富了凝結芽孢桿菌食品加工手段,延長了產(chǎn)品貨架期。2015年,Clara Fares等[5]嘗試將凝結芽孢桿菌加入意大利面食,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過面粉加工和烹飪后,芽孢數(shù)量級高達109cfu/100 g。Muhammed Majeed等[6]發(fā)現(xiàn)凝結芽孢桿菌MTCC 5856可應用于華夫餅等焙烤食品,并表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性,可延長產(chǎn)品貨架期。一般來說,益生菌受到食品加工手段和保藏工藝的限制,被局限應用在酸奶、果蔬汁等產(chǎn)品中。凝結芽孢桿菌由于優(yōu)良的抗逆性,具備了在糖果、餅干等產(chǎn)品中應用的潛力。

凝結芽孢桿菌高抗逆性也是其能順利通過人體胃腸道系統(tǒng)的保障。研究表明,凝結芽孢桿菌CGMCC 9951在pH2.0環(huán)境下處理兩小時,其存活率高達90%,而在膽鹽濃度0.9%(w/v)環(huán)境中處理4 h,活菌數(shù)僅下降了20%[7]。凝結芽孢桿菌以芽孢的形式進入消化系統(tǒng),在胃部吸水、膨脹,進入十二指腸后逐漸轉變?yōu)闋I養(yǎng)體,隨后在小腸中開始繁殖,整個過程持續(xù)4～6 h[8]。Maathuis等[9]研究顯示,凝結芽孢桿菌在通過人工胃腸后,其存活率高達70%。值得注意的是,有研究證明在停止服用凝結芽孢補充劑后,小鼠腸道內凝結芽孢桿菌數(shù)量會逐漸減少,直至最后消失[10]。Abhari等[11]也證實了凝結芽孢桿菌屬于過路菌,很難定植于腸道中。因此,凝結芽孢桿菌可能需要持續(xù)服用才能發(fā)揮其益生作用。

2 凝結芽孢桿菌對腸道健康的調節(jié)功能

大量研究表明,凝結芽孢桿菌對宿主腸道健康具備調節(jié)功能。最初,V Cavazzoni等[12]將凝結芽孢桿菌應用于禽類養(yǎng)殖,發(fā)現(xiàn)凝結芽孢桿菌可以提高飼料利用率以及生長效率。2010年,Zhou等[13]研究中發(fā)現(xiàn)凝結芽孢桿菌JU0616可提高飼養(yǎng)黃雞的各項理化指標,并指出腸道內凝結芽孢桿菌達到一定數(shù)值后,該菌的代謝產(chǎn)物會調節(jié)腸道消化功能。無獨有偶,2012年,S Lin等[14]研究也發(fā)現(xiàn)凝結芽孢桿菌可促進錦鯉腸道維生素的合成以及消化酶活力,提高錦鯉巨噬細胞以及溶菌酶的活性,增強錦鯉的免疫力,保證了存活率。后續(xù)研究中,2017年,趙娜等[15]發(fā)現(xiàn)凝結芽孢桿菌可以減少肉雞腸道中大腸桿菌的數(shù)量,提高免疫器官指數(shù)。隨著對凝結芽孢桿菌研究的不斷深入,其調節(jié)腸道健康功能的機制也逐漸清晰,通過總結與分析,其調節(jié)功能可能主要涉及以下三方面。

2.1 菌株對腸道消化功能的調節(jié)

作為芽孢桿菌的一員,凝結芽孢桿菌有著豐富的酶系統(tǒng),可分泌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶、脂酶等有益酶類,改善人們對高蛋白、碳水化合物的吸收,提高食品的營養(yǎng)利用率[8,11-12]。Batra等[16]研究發(fā)現(xiàn),凝結芽孢桿菌RCS3在生長過程中能分泌β-半乳糖苷酶,可將牛乳中的乳糖降解成葡萄糖和半乳糖,提高牛奶的易消化性以及甜度,有效緩解乳糖不耐癥。與曲霉菌、放線菌等產(chǎn)乳糖酶微生物相比,RCS3分泌的β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定高,在pH5～8范圍酶活力穩(wěn)定,并可有效避免工業(yè)生產(chǎn)中的污染,具備乳品工業(yè)開發(fā)的潛力。李文婷等[17]對實驗室保存的產(chǎn)酸乳酸菌株進行了乳糖酶篩選,鑒定得到凝結芽孢桿菌RY237,其所產(chǎn)的乳糖酶活性值可達4.98 U/mL。與RCS3相似,RY237所分泌的糖苷酶也呈現(xiàn)較高的穩(wěn)定性。Asokan S等[18]從土壤中分離芽孢桿菌時,發(fā)現(xiàn)凝結芽孢桿菌有產(chǎn)蛋白酶的潛質。后續(xù)研究中,凝結芽孢桿菌中的明星菌GBI-30,6086也被證明可分泌植物蛋白酶,從而促進上腸道中植物蛋白的消化,改善結腸的腸道環(huán)境,減少有毒代謝物質。添加該菌株后,豌豆組、大豆組、大米組里的總氮含量(TN)和氨基酸氮含量(AAN)與空白組相比均有提高,而大豆組與大米組TN/AAN值均下降一半,這說明該菌株對三種植物蛋白的吸收均有著顯著提升,并可將大豆以及大米中的植物蛋白降解成更小的肽分子以及游離氨基酸,以促進腸道代謝[19]。

另外,凝結芽孢桿菌還能產(chǎn)生雙乙酰、短鏈脂肪酸、維生素等代謝產(chǎn)物,刺激腸道蠕動,減少胺類等有害物質的產(chǎn)生,改善腸道代謝環(huán)境,從而改善糞便性質,避免毒素在體內堆積。研究表明,相比對照組,服用凝結芽孢桿菌Lilac-01能顯著改善便秘病人的糞便性狀,緩解排便滯留感,改善腸道環(huán)境[20]。凝結芽孢桿菌Lacris?-S在經(jīng)過臨床實驗后,也被證明能提高排便頻率,改善糞便形狀與顏色,降低腸道氨值,減少吲哚以及對甲酚數(shù)量,使糞便氣味得以改善[21]。

2.2 菌株對腸道菌群的調節(jié)

腸道菌群與宿主的健康密切相關,腸道菌群的異常易導致宿主生理功能障礙,進而引發(fā)疾病。2002年,Katsutoshi Ara等[21]的研究表明,高蛋白飲食會導致雙歧桿菌及乳酸菌數(shù)量下降,使腸球菌以及艱難梭狀桿菌數(shù)量上升。在飲食中添加凝結芽孢桿菌SANK 7025后,人體糞便中雙歧桿菌以及乳酸菌含量分別從9.8%和5%上升至10.1%和5.4%,而艱難梭狀桿菌則從7.5%下降至7.2%,糞便pH也明顯降低。Haldar等[22]的研究表明,通過服用凝結芽孢桿菌B37,35 d后小鼠糞便中的大腸桿菌下降了兩個數(shù)量級,而乳酸菌的數(shù)量則提升了100倍。Edna P Nyangale等[23]測定了老年人腸道菌群的變化,發(fā)現(xiàn)與服用安慰劑相比,凝結芽孢桿菌組老人腸道中柔嫩菌、直腸真桿菌等微生物群體占據(jù)明顯優(yōu)勢,丁酸鹽、乙酸鹽和丙酸鹽的濃度也有顯著提高。另外,研究者發(fā)現(xiàn)凝結芽孢桿菌可抑制小鼠體內耐萬古霉素腸球菌的數(shù)量[10]。Johnston等[24]也指出凝結芽孢桿菌是改善抗生素導致的腸道菌群失調和相關疾病的優(yōu)勢菌株。

凝結芽孢桿菌可以改善飲食、年齡、致病菌、抗生素濫用等所導致腸道菌群的失調,其協(xié)同其他益生菌調節(jié)紊亂菌群的機制可能涉及以下方面:

首先,凝結芽孢桿菌會改變腸道環(huán)境,促進雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌生長,緩解高脂飲食、年齡增長所帶來的菌群失調。凝結芽孢桿菌為兼性厭氧菌,在腸胃中能消耗游離氧,降低氧化還原趨勢,這被證明有利于雙歧桿菌等厭氧微生物的生長[11,25]。另外,凝結芽孢桿菌能大量分泌L型乳酸,從而降低胃腸道內的pH,抑制致病菌。Lidan Ye等[26]研究表明,凝結芽孢桿菌BC106在以碳水化合物(260 g/L)為原料,其產(chǎn)酸量達到 215.7 g/L,L型乳酸的純度達到95%。

另一方面,凝結芽孢桿菌在腸道繁殖時能分泌大量細菌素,從而維持胃腸道免受致病菌的侵襲。1998年,Hyronimus等[27]在凝結芽孢桿菌I4中發(fā)現(xiàn)凝固素,后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),該細菌素對大部分革蘭氏陽性,例如腸球菌、李斯特菌、明珠串球菌等具有較強的抑制作用。凝固素屬類片球菌素肽類物質,由質粒編碼,與乳酸片球菌分泌的片球菌素(pediocin)極為相似,呈無規(guī)則卷曲狀,僅在C末端存在一個氨基酸差異[28]。2009年,Riazi等[29]從凝結芽孢桿菌ATCC7050分離出細菌素Lactosporin。研究顯示,Lactosporin可能不屬于傳統(tǒng)I型或II型細菌素,它能被蛋白酶以及脂肪酶降解,這說明其可能擁有部分脂質的特性。作為一種陰離子抗菌物質,Lactosporin可穿透致病菌表面,導致細胞內的氨基酸、無機鹽離子泄露,從而起到抑制病原菌的作用。此外,該細菌素表現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性,但易受pH影響[29-30]。2015年,Abdhul等[31]從印度曼尼普爾地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到的凝結芽孢桿菌BDU3,該菌能產(chǎn)生一種新的細菌素,可抑制MIC(最小抑菌濃度)在0.5～2.5 μg/mL之間的病原體,對食品中經(jīng)常出現(xiàn)的金黃色葡萄球菌、腸球菌等致病菌有著顯著抑制作用。凝結芽孢桿菌BDU3所產(chǎn)的細菌素抗逆性優(yōu)異,能耐受pH2.0和0.2%(w/v)膽鹽濃度的環(huán)境,可順利到達腸道并保持生物活性,進而發(fā)揮腸道益生作用。綜上所述,凝結芽孢桿菌能產(chǎn)生多種細菌素以及細菌素物質,且穩(wěn)定性較強,不易受到有機試劑以及惡劣環(huán)境的影響,因此可便捷的應用于食品產(chǎn)業(yè)中,發(fā)揮其調節(jié)腸道菌群的作用。

2.3 菌株對腸道免疫力的調節(jié)

腸道免疫系統(tǒng)是宿主健康的重要防線。凝結芽孢桿菌作為免疫佐劑,能幫助宿主對抗病毒的感染,對腫瘤免疫也有增強作用,是近年來該菌株的研究熱點之一。

2009年,研究者發(fā)現(xiàn)凝結芽孢桿菌Ganeden BC30TM能誘導人體T細胞大量分泌TNF-α從而應對A型流感以及腺病毒[32]。Gitte S Jensen等[33]發(fā)現(xiàn)凝結芽孢桿菌的細胞壁以及代謝產(chǎn)物能誘導Th2細胞因子IL-4、IL-6、IL-10的產(chǎn)生,抑制IL-2的產(chǎn)生,并能誘導PHA表達IL-6,降低PHA誘導產(chǎn)生腫瘤誘導因子,增強PHA和PWM對IL-10的表達。后續(xù)研究中,研究者還發(fā)現(xiàn)凝結芽孢桿菌可通過對核轉錄系統(tǒng)NF-kB P65的調節(jié),一定程度上緩解炎癥病狀。Leo R Fitzpatrick等[34]實驗表明,凝結芽孢桿菌能緩解艱難梭狀桿菌導致的結腸病理(腺窩損傷、水腫、白血球指標等),抑制核轉錄系統(tǒng)RelA蛋白(即NF-kB P65)分泌炎癥因子IL-8。M Ratna Sudha等[35]研究表明凝結芽孢桿菌能抑制炎癥系細胞COX-2,進而抑制RelA蛋白,對促炎癥因子IL-12,TNF-α和IFN-γ表達出抑制作用。

另有一些研究表明,凝結芽孢桿菌可提高中性粒細胞(PMN)的吞噬活力,抑制其由活性氧誘導的氧化應激反應[25]。有報道表明凝結芽孢桿菌能增強自然殺傷細胞(NK)的活性,誘導NK細胞上活性標記物CD69的表達,從而激活細胞CD3-CD56+。體外實驗還證明凝結芽孢桿菌與K562腫瘤細胞共培養(yǎng)后,能增強NK細胞上CD107a的表達[33]。Kathleen F Benson等[36]也在體外實驗中發(fā)現(xiàn),凝結芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物能促進抗原遞呈細胞成熟,從而調節(jié)宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟。

3 凝結芽孢桿菌保護腸道健康的臨床應用

基于上述腸道調節(jié)功能,凝結芽孢桿菌已被廣泛應用于臨床治療中。美國Ganeden公司所研發(fā)的凝結芽孢桿菌GBI-30,6086是目前研究較為深入的明星菌株,已經(jīng)展開了11項臨床研究,發(fā)現(xiàn)其對治療腸易激綜合征有著積極的影響,并可調節(jié)宿主腸道吸收和免疫力。目前,已有多株凝結芽孢桿菌被證明可用于緩解腸易激綜合征、腸道脹氣、腹瀉、功能性腹痛等腸道功能異常癥狀,見表1。值得注意的是,不同凝結芽孢桿菌種之間差異較大,因此,針對不同的凝結芽孢桿菌,應合理選擇其在腸道健康應用中的發(fā)展方向,發(fā)揮其益生價值。

表1 凝結芽孢桿菌與腸道健康的臨床應用Table 1 Bacillus coagulans and clinical applications of intestinal health

4 展望

凝結芽孢桿菌具備優(yōu)良的生物特性以及其良好的益生特性,相比傳統(tǒng)乳酸菌,在加工和儲存上具有優(yōu)勢,是一類很有開發(fā)前景的益生菌。近幾年,國內凝結芽孢桿菌產(chǎn)品主要集中在飼料以及藥劑的開發(fā),在食品領域的應用還處于起步狀態(tài)。目前,關于凝結芽孢桿菌發(fā)揮其益生作用的深層作用機制以及途徑依然有待探索,該菌在胃腸道中的消長規(guī)律以及益生特性也仍有待于發(fā)掘。隨著不斷深入研究,凝結芽孢桿菌的益生產(chǎn)品必然會不斷發(fā)展,發(fā)揮其商業(yè)價值。值得注意的是,凝結芽孢桿菌在益生上發(fā)揮的作用并非是決定性的,因此應當進一步研究其在益生菌群中扮演的角色,為實際的生產(chǎn)提供系統(tǒng)而全面的研究。