白 雪,楊 爽,孟 鑫

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省肉類工程中心,遼寧錦州 121000)

隨著社會的發(fā)展,乳品行業(yè)在我國占據(jù)著重要的地位,其中奶貝和酸奶的生產(chǎn)和消費(fèi)受到人們的廣泛關(guān)注。乳品在經(jīng)過發(fā)酵或加工處理時會產(chǎn)生揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分,這主要是因?yàn)槿樵诩庸み^程中會發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)從而形成風(fēng)味,這些反應(yīng)包括蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的分解、糖的降解、氨基酸與化合物間的反應(yīng)以及各種反應(yīng)之間的相互作用,而這些風(fēng)味成分很大程度上來源于脂肪酶、肽酶和蛋白酶等風(fēng)味酶[1],尤其是脂肪酶。脂肪酶能夠?qū)⒏视腿ニ獬筛视秃椭舅?常廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、藥品、環(huán)境治理等方面[2],是重要的工業(yè)酶制劑品種之一,普遍存在于動物、植物和微生物組織中[3]。在乳品加工過程中添加脂肪酶能增強(qiáng)乳品風(fēng)味,例如,近年來有研究在賽達(dá)干酪生產(chǎn)中加入米曲霉可使干酪風(fēng)味明顯增強(qiáng),成熟期也由幾個月縮短到幾小時;張碩[4]從豬肉脂肪組織中提取了內(nèi)源性脂肪酶并添加到乳品中,經(jīng)鑒定能夠有效改善乳品風(fēng)味。

然而,改善乳品風(fēng)味是添加外源性脂肪酶,還是內(nèi)源性脂肪酶,研究尚處于探索階段。為此,本課題向奶貝和酸奶中添加微生物脂肪酶,利用電子鼻[5-8]采集添加微生物脂肪酶處理前后兩種樣品中的風(fēng)味香氣,并利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HS-SPME-GC-MS)[9-12]檢測奶貝和酸奶中風(fēng)味物質(zhì)的變化情況,以期為風(fēng)味乳制品的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

微生物脂肪酶 是從土壤中篩選的一株真菌產(chǎn)脂肪酶,在30 ℃、pH為5的條件下采用發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵3 d制得,發(fā)酵液中脂肪酶活力測定采用改進(jìn)的銅皂法[13]測得酶活為7.6 U/mL,由本實(shí)驗(yàn)室提供;奶貝(固體塊狀)、酸奶(凝固型) 遼寧錦州某超市;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純;發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖0.5 g,胰蛋白胨2 g,K2HPO40.1 g,MgSO40.05 g,(NH4)2SO40.1 g,1 mL橄欖油,定容至100 mL,115 ℃,滅菌15 min。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent 公司;75 μm CAR/PDMS SPME萃取頭 上海楚定分析儀器有限公司;PEN3電子鼻 德國AIR SENSE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 電子鼻檢測揮發(fā)性物質(zhì) 取上述兩份發(fā)酵酶液10 mL分別與1 g奶貝、10 g酸奶攪拌混合均勻,在4 ℃、pH6條件下靜置30 min為酶液處理組,另一組為未添加微生物脂肪酶的樣品,兩組分別取10 mL混合液放入燒杯中,迅速加蓋密封,20 min后開始測量,兩組樣品重復(fù)測定兩次。該實(shí)驗(yàn)中電子鼻信號的采集時間定為50 s,清洗時間為120 s。PEN3型便攜式電子鼻傳感器性能描述見表1。

表1 PEN3型便攜式電子鼻傳感器性能描述Table 1 Performance description of PEN3 portable electronic nose sensor

1.2.2 HS-SPME-GC-MS分析測定揮發(fā)性物質(zhì) 準(zhǔn)確稱取奶貝溶液和酸奶溶液各5 mL置于20 mL頂空瓶中,加入3 mL氯化鈉溶液和磁轉(zhuǎn)子,迅速用聚四氟乙烯隔墊密封,于磁力攪拌器中45 ℃加熱平衡10 min,用已活化好的75 μm CAR/PDMS SPME萃取頭(270 ℃活化30 min)頂空吸附30 min后,將萃取頭插入氣質(zhì)進(jìn)樣口,解吸5 min。每個樣品重復(fù)測定兩次。

色譜條件:HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣He,流速1 ml/min;進(jìn)樣口溫度為270 ℃;程序升溫:柱初溫57 ℃,保持3 min,以4 ℃/min升溫至260 ℃,保持10 min;分流比5∶1。

質(zhì)譜條件:色譜-質(zhì)譜接口溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃,電子能量70ev,四級桿溫度150 ℃,質(zhì)量掃描范圍為30～550(m/z)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

電子鼻數(shù)據(jù)分析:取穩(wěn)定后第47～49 s間的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行主成分分析(PCA)。

GC-MS數(shù)據(jù)分析:揮發(fā)性成分通過計算機(jī)檢索與Nist和Wiley標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫匹配進(jìn)行定性分析;采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量計算出各揮發(fā)性成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻檢測微生物脂肪酶對奶貝風(fēng)味的影響

從圖1A、B可以看出,經(jīng)過微生物脂肪酶處理的奶貝和未經(jīng)過微生物脂肪酶處理的奶貝在風(fēng)味輪廓上存在著明顯的差異,添加微生物脂肪酶的奶貝香氣比未添加微生物脂肪酶的奶貝香氣變化明顯,從圖中可以看出R2、R7、R9傳感器的響應(yīng)值變化明顯,說明經(jīng)過微生物脂肪酶處理后,奶貝中的氮氧化合物R2、硫化物R7、芳香成分和有機(jī)硫化物R9含量有所增加,這就說明經(jīng)過微生物脂肪酶酶解后產(chǎn)生了更多的揮發(fā)性成分,可在一定程度上有效提高奶貝香氣,改善奶貝風(fēng)味。

采用主成分分析(PCA)方法對微生物脂肪酶處理前后奶貝中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析,如圖1C所示,圖中的橫、縱坐標(biāo)分別表示PCA的第一主成分的貢獻(xiàn)率和第二主成分的貢獻(xiàn)率,貢獻(xiàn)率越大,說明主要成分可以較好地反映指標(biāo)信息[14-15]。其中,第一主成分的方差貢獻(xiàn)率為99.921%,第二主成分的方差貢獻(xiàn)率為0.075%,貢獻(xiàn)率總和大于95%以上,說明PC1和PC2可以代表奶貝樣品揮發(fā)性風(fēng)味的主要特征。從微生物脂肪酶處理的奶貝樣品與未處理的奶貝樣品之間的距離來看,經(jīng)過微生物脂肪酶處理的奶貝樣品的距離變遠(yuǎn),說明處理后奶貝的氣味成分差異顯著。從圖中可以看出,代表空白樣品的信息采集點(diǎn)位于效果圖左邊,代表添加微生物脂肪酶的樣品的信息采集點(diǎn)向右移動,電子鼻剛好能區(qū)分兩樣品。結(jié)論表明,通過主成分分析方法能有效的區(qū)分添加及未添加微生物脂肪酶奶貝樣品的風(fēng)味特征。

圖1 電子鼻檢測經(jīng)微生物脂肪酶處理前后的奶貝樣品Fig.1 Electronic nose detection of microbial lipase before and after treatment of milk samples注:A:未經(jīng)微生物脂肪酶處理的奶貝;B:經(jīng)微生物脂肪酶處理的奶貝;C:酶處理前后奶貝的PCA圖。

2.2 電子鼻檢測微生物脂肪酶對酸奶風(fēng)味的影響

電子鼻檢測微生物脂肪酶處理前后傳感器響應(yīng)變化曲線如圖2A、B所示,兩樣品經(jīng)過傳感器,每條曲線的位置相似,只是相對電阻值的大小發(fā)生了改變,說明部分物質(zhì)在含量上有不同程度的變化。添加微生物脂肪酶的酸奶的香氣比未添加微生物脂肪酶的酸奶的香氣變化明顯,響應(yīng)值變化較為明顯的傳感器分別是R2、R7、R9,說明經(jīng)過微生物脂肪酶處理后,酸奶中的硫化物R7、芳香成分和有機(jī)硫化物R9、氮氧化合物R2均有所增加,這說明在酸奶中添加微生物脂肪酶能對酸奶風(fēng)味的改善有一定的作用。

采用PCA(主成分分析)方法對微生物脂肪酶處理前后酸奶中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析,見圖2C,圖中的每個橢圓代表同批次酸奶風(fēng)味的數(shù)據(jù)采集點(diǎn)。通過圖2C可以看出,兩樣品分布在圖中的不同位置,說明添加及未添加微生物脂肪酶的酸奶在香氣上存在著差別,電子鼻可以很好的將兩者區(qū)分。其中,第一主成分的方差貢獻(xiàn)率達(dá)到99.54%,PC1和PC2貢獻(xiàn)率之和達(dá)到99.99%,能較好地反映數(shù)據(jù)信息,說明PC1和PC2可以代表酸奶樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要特征。這表明通過PCA方法能有效的區(qū)分添加及未添加微生物脂肪酶酸奶樣品的風(fēng)味特征。

圖2 電子鼻檢測經(jīng)微生物脂肪酶處理前后的酸奶樣品Fig.2 Electronic nose detection before and after microbial lipase treatment of yogurt samples注:A:未經(jīng)微生物脂肪酶處理的酸奶;B:經(jīng)微生物脂肪酶處理的酸奶;C:酶處理前后酸奶的PCA圖。

2.3 HS-SPME-GC-MS測定結(jié)果

采用HS-SPME-GC-MS檢測出微生物脂肪酶處理后奶貝,酸奶兩種樣品的揮發(fā)性化合物分別為32種和39種,主要為醛類、醇類、酸類、酮類、氮氧化合物等。與未經(jīng)過微生物脂肪酶處理的兩種樣品相比,經(jīng)過微生物脂肪酶處理的兩種樣品,其醛類化合物、醇類化合物、酸類化合物、酮類化合物的相對含量增加明顯,如圖3所示,由此可見,這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與乳品風(fēng)味的形成密切相關(guān)。

2.3.1 醛類化合物 醛類化合物是乳制品中重要的風(fēng)味物質(zhì)之一,屬于不穩(wěn)定的中間體化合物,在一定條件下易被還原成相應(yīng)的醇,是各種氧化風(fēng)味的來源[16]。從圖3可以看出,未處理的奶貝和酸奶揮發(fā)性成分中醛類物質(zhì)的相對含量為6.59%、0.51%,經(jīng)過微生物脂肪酶處理的奶貝樣品中檢測出的醛類物質(zhì)的相對含量為7.75%,酸奶樣品中檢測出的醛類物質(zhì)的相對含量為7.67%,可以得知兩種樣品檢測出的醛類物質(zhì)的相對含量均比原樣品高,由于這類化合物的閾值較低,因而仍是奶貝和酸奶風(fēng)味物質(zhì)中不可缺少的一部分。奶貝和酸奶中的醛類化合物來源于脂肪酸代謝、氨基酸轉(zhuǎn)氨作用或Strecker降解。酸奶和奶貝中檢測出的壬醛一般具有青草味。

2.3.2 酮類化合物 酮類化合物風(fēng)味獨(dú)特,閾值低,乳制品中最重要的揮發(fā)性物質(zhì)是甲基酮類物質(zhì),它們會賦予奶貝和酸奶水果、花香等香氣風(fēng)味物質(zhì)。由圖3可知,未處理的奶貝和酸奶中的酮類物質(zhì)的相對含量為0.21%、2.92%,經(jīng)過微生物脂肪酶處理的奶貝和酸奶樣品中的酮類化合物的相對含量分別為0.27%、3.7%,從而可以看出,兩種樣品檢測出的揮發(fā)性成分中酮類物質(zhì)的相對含量均比未處理的樣品中酮類物質(zhì)的相對含量高。奶貝中檢測出的2-庚酮具有類似梨的水果香味,酸奶中檢測出的2-壬酮具有新鮮味,Tuba等[17]指出壬酮對酸奶產(chǎn)生的風(fēng)味具有一定貢獻(xiàn)。雖然酮類化合物在兩種樣品中的相對含量較低,但對風(fēng)味的形成也具有不可忽視的作用。

圖3 兩種樣品中揮發(fā)性化合物的相對含量Fig.3 The relative content of volatile compounds in both samples

2.3.3 酸類化合物 酸類化合物在乳制品中主要表現(xiàn)在滋味上,氣味上表現(xiàn)不明顯,本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)過微生物脂肪酶處理的奶貝和酸奶檢測出的酸類物質(zhì)的相對含量為4.53%、9.76%,而原樣品中的酸類物質(zhì)的相對含量分別為3.89%、0.73%,由此可以看出,經(jīng)過處理的兩種樣品檢測出的酸類物質(zhì)的相對含量比原樣品檢測出的酸類物質(zhì)的相對含量高,其中酸奶樣品中辛酸的相對含量變化最明顯,它是重要的揮發(fā)性風(fēng)味香氣的組成部分,表現(xiàn)出奶油香味,這說明微生物脂肪酶可以水解脂肪酸并釋放出具有特征的脂肪酸,對增強(qiáng)乳品香氣具有一定的作用。

2.3.4 醇類化合物 醇類化合物是乳品中比較普遍存在的風(fēng)味物質(zhì),它主要是由脂肪酸氧化酶作用于多不飽和脂肪酸衍生而來的。由圖3可以看出,添加微生物脂肪酶的奶貝中醇類物質(zhì)的相對含量為7.98%,酸奶中醇類物質(zhì)的相對含量為10.97%,而原樣品中的醇類物質(zhì)的相對含量分別為0.26%、0.9%,由此可知,這兩種樣品中醇類物質(zhì)的相對含量都要高于原樣品中醇類物質(zhì)的相對含量,這可能是由于脂肪酶參與脂肪的水解及氧化反應(yīng),水解產(chǎn)物能有效提高乳品原有的風(fēng)味,所以醇類化合物對乳品風(fēng)味的形成也極為重要。

2.3.5 其它化合物 酯類化合物在乳品中主要是通過脂肪酸水解和微生物代謝產(chǎn)生,除了能夠賦予奶貝和酸奶類似花果香外,還可能緩和因碳鏈脂肪酸濃度過高所帶來的刺激性味道,從而賦予奶貝和酸奶更加柔和的香氣。經(jīng)微生物脂肪酶處理后兩種樣品檢測出的酯類化合物的相對含量變化不明顯,但它仍對乳品風(fēng)味的形成有著重要的作用。

微生物脂肪酶處理前后兩種樣品中檢測出的烷烴類化合物對乳品風(fēng)味影響不大,但它們是形成乳品風(fēng)味有貢獻(xiàn)的重要中間體,對形成乳品的奶香具有不可忽視的基底作用。

奶貝和酸奶樣品經(jīng)過微生物脂肪酶處理前后通過電子鼻檢測可以看出氮氧化合物、硫化物、芳香成分和有機(jī)硫化物等含量有所增加,GC-MS檢測可以看出醛類化合物、醇類化合物、酸類化合物、酮類化合物的相對含量比未處理的樣品的相對含量高。由此可以看出,微生物脂肪酶在一定程度上能改善奶貝和酸奶的風(fēng)味,使其風(fēng)味更加濃郁,這為進(jìn)一步進(jìn)行乳制品風(fēng)味的研究提供了一定依據(jù)。

3 結(jié)論

電子鼻檢測可以很好的區(qū)分添加微生物脂肪酶處理前后奶貝和酸奶中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分的含量變化;PCA分析方法能說明微生物脂肪酶酶解后產(chǎn)生的揮發(fā)性成分有效的提高了奶貝和酸奶原有的風(fēng)味。經(jīng)GC-MS檢測微生物脂肪酶處理的奶貝和酸奶中的揮發(fā)性物質(zhì)成分主要為醛類、醇類、酸類、酮類、氮氧化合物等,這與電子鼻檢測的結(jié)果一致,這進(jìn)一步說明了微生物脂肪酶對改善乳品風(fēng)味具有不可忽視的貢獻(xiàn)作用。