宋利娜 徐麗麗 羅歡 楊乃龍

青島大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，青島 266000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenstrual osteoporosis，PMOP)是由于女性絕經(jīng)后雌激素水平下降導(dǎo)致的以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的骨形成與骨吸收失衡的代謝性骨病，因此雌激素與雌激素受體調(diào)節(jié)劑[雷洛昔芬(raloxifene，RXL)]均可用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的治療。近年來(lái)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endooplasmic stress，ER)對(duì)骨質(zhì)疏松的研究得到廣泛關(guān)注，有學(xué)者認(rèn)為ER在細(xì)胞的增殖分化、分泌、凋亡過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用[1-2]。雷洛昔芬是否通過(guò)此途徑影響成骨細(xì)胞的增殖及分化尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將雷洛昔芬(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L)作用于3T3-E1細(xì)胞，觀察它們對(duì)細(xì)胞增殖及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活力的影響，同時(shí)應(yīng)用qRT-PCR的方法觀察IRE-1、ATF6及eIF2α的表達(dá)情況，研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路是否參與SERM對(duì)成骨細(xì)胞增殖及分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

3T3-E1細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，雷洛昔芬購(gòu)自美國(guó)Santa公司，α-DMEM、胎牛血清、雙抗(美國(guó)GIBCO公司)，DMSO(美國(guó)Sigma公司)，CCK8試劑盒、堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，TRIZOL(美國(guó)Gibco公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(美國(guó)Tiangen公司)，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：3T3-E1細(xì)胞內(nèi)加入10%胎牛血清和1%雙抗的α-DMEM培養(yǎng)液5 mL，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于合適培養(yǎng)基中，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次，待細(xì)胞增長(zhǎng)至80%左右時(shí)，取細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖：3T3-E1細(xì)胞懸液以1×105/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h使細(xì)胞貼壁。加入終濃度為10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L的雷洛昔芬培養(yǎng)液及僅加培養(yǎng)液的對(duì)照組。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)調(diào)零孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h檢測(cè)吸光度，終止反應(yīng)。每孔加入10 μL的CCK8溶劑，繼續(xù)孵育4 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值[D(450)]。

1.2.3ALP活力測(cè)定：將細(xì)胞消化、離心、重懸，以細(xì)胞數(shù)1×105/孔接種于96孔板，分組同上，放置37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，另設(shè)酚標(biāo)準(zhǔn)孔。具體步驟如下：5 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液，緩沖液和基質(zhì)液各50 μL，充分混勻，37 ℃水溶15 min，加顯色劑150 μL，輕輕振搖孔板混勻，于酶標(biāo)儀520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值(OD值)并記錄結(jié)果。

培養(yǎng)細(xì)胞中ALP活力(金氏單位/gprot)=[(測(cè)定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.02 mg/mL)/待測(cè)樣本蛋白濃度(gprot/mL)

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)IRE-1、ATF6及eIF2α的表達(dá)：3T3-E1細(xì)胞接種于6孔板，37 ℃、5%CO2條件下過(guò)夜培養(yǎng)后加入10-7mol/L雷洛昔芬，于24 h后收集細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞樣本中總RNA，取1μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后用RealTime-PCR試劑盒對(duì)目的基因進(jìn)行定量檢測(cè)，分別取1 μL cDNA，上游和下游引物各0.6 μL，2×Premix 10 μL，反應(yīng)體系20 μL。反應(yīng)條件：95℃15 min，95℃15 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增IRE-1、ATF6及eIF2α(表1)，以β-actin為內(nèi)參，采用計(jì)算2-ΔΔCT的定量方法分析數(shù)據(jù)。

表1 基因序列及其引物Table 1 Gene sequences and primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 3T3E-1細(xì)胞形態(tài)

3T3E-1細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形、三角形或多角形等不規(guī)則形，細(xì)胞之間通過(guò)長(zhǎng)短不一的樹(shù)突相互連接(圖1)。

圖1 3T3E-1細(xì)胞形態(tài)(40×)Fig.1 3T3 E-1 cells Morphology (40×)

2.2 雷洛昔芬對(duì)3T3-E1細(xì)胞增殖的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L組的OD值分別為0.434±0.029、0.475±0.016、0.539±0.009、0.637±0.018(圖2)。3T3-E1細(xì)胞增殖測(cè)定與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)各組OD值均顯著增高(P<0.05)，且隨著雷洛昔芬濃度的升高，測(cè)定OD值逐漸增高，各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 不同濃度雷洛昔芬對(duì)3T3-E1細(xì)胞增殖的影響(與對(duì)照組比較，aP<0.05)Fig.2 Effects of different concentrations of raloxifene on the proliferation of 3T3-E1 cells(Comparison with control group，aP<0.05)

2.3 雷洛昔芬對(duì)3T3-E1細(xì)胞成骨分化的影響

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L組的ALP活力值依次為 0.016±0.002、0.031±0.002、0.052±0.004、0.062±0.007(圖3)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組各組ALP活力均增高(P<0.05)，且高濃度雷洛昔芬促進(jìn)成骨活性的能力高于其他濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 不同濃度雷洛昔芬對(duì)3T3-E1細(xì)胞ALP活力的影響(與對(duì)照組比較，aP<0.05)Fig.3 Effects of different concentrations of raloxifene on alkaline phosphatase activities of 3T3-E1 cells(Comparison with control group，aP<0.05)

2.4 qRT-PCR檢測(cè)IRE-1、ATF6及eIF2α的表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞24 h eIF2α、ATF6及IRE-1mRNA的相對(duì)表達(dá)水平為1。10-7mol/L RXL組細(xì)胞24 h eIF2α、ATF6及IRE-1mRNA的相對(duì)表達(dá)水平分別為3.723±0.313、3.619±0.239、4.582±0.875(圖4)，雷洛昔芬組IRE-1、ATF6及eIF2αmRNA的表達(dá)水平均較對(duì)照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 10-7 mol/L雷洛昔芬對(duì)ERS的影響(與對(duì)照組比較，aP<0.05)Fig.4 Effect of 10-7 mol/L raloxifene on endoplasmic reticulum stress (ERS)(Comparison with control group，aP<0.05)

3 討論

雷洛昔芬是第2代人工合成的非類(lèi)固醇類(lèi)苯噻吩化合物，是第1個(gè)被批準(zhǔn)用于預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑[3]，具有組織特異性，對(duì)體內(nèi)某些組織(如骨組織)具有雌激素作用，而對(duì)另外一些組織(如乳腺、子宮內(nèi)膜)表現(xiàn)為抗雌激素作用[4]。與雌激素替代療法相比較，它不增加子宮內(nèi)膜的厚度，不引起陰道出血，可顯著降低浸潤(rùn)性乳腺癌的危險(xiǎn)性，并且對(duì)血脂代謝有良好的作用，因此成為臨床上防治PMOP的理想選擇。

雷洛昔芬能有效治療絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥。RXL不僅可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖及分化，從而調(diào)節(jié)骨形成及骨重建，并且可抑制破骨細(xì)胞的活性，從而抑制骨吸收[5]。Curiel等[6]研究發(fā)現(xiàn)RLX可降低去卵巢骨質(zhì)疏松模型的高轉(zhuǎn)換狀態(tài)，減少脛骨、股骨及腰椎松質(zhì)骨小梁的重吸收及骨量丟失。研究表明，雷洛昔芬的作用在10-9mol/L～10-7mol/L濃度范圍內(nèi)呈劑量相關(guān)性，隨濃度的增加對(duì)成骨細(xì)胞的刺激作用增加，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L雷洛昔芬作用于3T3-E1細(xì)胞，結(jié)果顯示CCK8及ALP均升高，亦隨雷洛昔芬濃度的增加CCK8及ALP活力升高，表明雷洛昔芬可促進(jìn)體外培養(yǎng)的3T3-E1細(xì)胞的增殖及分化，與以往的研究結(jié)果相一致。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最大的細(xì)胞器，是蛋白質(zhì)及脂質(zhì)合成、折疊、翻譯后修飾，細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞鈣水平等活動(dòng)的重要場(chǎng)所[7-8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白集聚和膜內(nèi)外鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失去正常的生理功能從而引發(fā)細(xì)胞一系列適應(yīng)性調(diào)節(jié)過(guò)程，稱(chēng)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[9](endoplasmic reticulum stress，ERS)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)激活胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)反應(yīng)腔內(nèi)未折疊蛋白的壓力，稱(chēng)為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，UPR是細(xì)胞的保護(hù)性反應(yīng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)是否能夠恢復(fù)，取決于刺激的強(qiáng)度和持續(xù)的時(shí)間。

現(xiàn)有的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要包括以下3條通路：PERK(protein kinase R-liae ER kinase)通路、ATF6(activating transcription factor 6)通路、IRE1(inositol-requiring enzyme 1)通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過(guò)程與免疫球蛋白BiP(immunoglobulin binding protein，or glucose regulating protein78，又稱(chēng)為GRP78)的游離密切相關(guān)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的情況下，GRP78與上述3個(gè)蛋白結(jié)合，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境紊亂時(shí)導(dǎo)致Bip與PERK、ATF6及IRE1解離，而與GRP78解離后的3個(gè)蛋白分別被激活，啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)作用[10]。輕度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠激發(fā)成骨細(xì)胞的功能，從而促進(jìn)骨組織的形成。Hamamura等[11]發(fā)現(xiàn)，機(jī)體處于應(yīng)激時(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)ATF4/CHOP通路影響成骨細(xì)胞的分泌及分化功能。目前研究顯示，PERK路徑能夠通過(guò)上調(diào)eIF-2α的磷酸化水平激活成骨細(xì)胞活性，最終增加骨形成并抑制破骨細(xì)胞形成以減少骨破壞[12-13]。在低水平的ERS下，ATF4的表達(dá)在成骨細(xì)胞中升高，同時(shí)骨形成因子Runx2等的表達(dá)也升高，從而促進(jìn)骨形成，有效緩解骨質(zhì)疏松的進(jìn)展[14]，XBP1能夠直接捆綁RUNX2蛋白從而促進(jìn)骨形成。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胍那芐是通過(guò)ERS介導(dǎo)的信號(hào)通路治療骨質(zhì)疏松的藥物，并發(fā)現(xiàn)對(duì)緩解骨質(zhì)疏松有一定效果[15]。有研究發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞的增殖能夠通過(guò)IRE1信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，同時(shí)能促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌膠原蛋白及骨鈣素。同時(shí)有研究表明，高濃度的蛇床子素能促進(jìn)ALP蛋白的表達(dá)，而過(guò)多的ALP蛋白能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集，超過(guò)ER處理范圍時(shí)引發(fā)ERS，而蛇床子素具有性激素樣作用。綜上所述，ERS與成骨細(xì)胞的增殖及分化有密切關(guān)系，因此本實(shí)驗(yàn)在刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因表達(dá)時(shí)，選用了較高濃度10-7mol/L的雷洛昔芬，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的IRE-1、ATF6及eIF2αmRNA水平均有所升高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與了成骨細(xì)胞的增殖及分化。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥常發(fā)生在絕經(jīng)后5～10年，主要與體內(nèi)雌激素下降有關(guān)，臨床表現(xiàn)為骨痛、骨骼畸形，嚴(yán)重者可發(fā)生骨折，使生活質(zhì)量下降增加死亡率及病殘率，它已成為一種嚴(yán)重的社會(huì)公共健康問(wèn)題。雷洛昔芬作為一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，與雌激素相比，能夠減少子宮內(nèi)膜癌及乳腺癌的危險(xiǎn)性，因此為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者提供了又一選擇。隨著雷洛昔芬在臨床上逐漸被應(yīng)用，其作用機(jī)制也逐漸得到深入研究，因成骨細(xì)胞的增殖、分化、成熟的過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜而精密的調(diào)節(jié)過(guò)程，涉及多個(gè)骨生成相關(guān)的信號(hào)通路，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路參與其中及是否有其他機(jī)制參與，仍有待進(jìn)一步研究。