曾汝君 馬亞仙 張郡 羅云瑤 譙小勇 劉玲 許良智*

1.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 成都 610041 2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院西部婦幼研究院，四川 成都 610041

骨代謝包括骨形成和骨吸收兩個(gè)基本過(guò)程，在生理狀態(tài)下二者處于動(dòng)態(tài)平衡中。破骨細(xì)胞由造血系統(tǒng)中的單核巨噬前體細(xì)胞分化而來(lái)，在骨吸收的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[1]。小鼠破骨細(xì)胞前體細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞可分化為成熟且有功能的破骨細(xì)胞[2]，因此被廣泛作為研究破骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)及代謝過(guò)程的細(xì)胞模型[3]。

美國(guó)模式菌種收集中心推薦RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)液為DMEM(high-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium)[4-5]。但有關(guān)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)的研究中，選擇α-MEM(MEM Eagle，alpha modification)作為培養(yǎng)基也較為常見(jiàn)[6-10]。與DMEM高糖培養(yǎng)基相比，α-MEM培養(yǎng)基含有的氨基酸和維生素種類(lèi)更為豐富，而DMEM培養(yǎng)基中葡萄糖及氨基酸濃度更高，這些差異都可能在不同程度上影響破骨細(xì)胞的增殖及分化能力，使得各研究結(jié)果難以進(jìn)行橫向比較。然而目前尚缺乏比較以上兩種培養(yǎng)基對(duì)RAW264.7細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞分化結(jié)果的影響的研究，因此本實(shí)驗(yàn)擬用α-MEM和DMEM高糖培養(yǎng)基分別培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，觀察在促分化條件下RAW264.7細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中細(xì)胞分化的能力，探究不同培養(yǎng)條件下破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化能力。

1 材料與方法

1.1 材料

抗TRAP、NFATc1、Cathepsin K抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，抗GAPDH、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自中國(guó)成都正能抗體公司。重組鼠核因子κB受體激活蛋白配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)購(gòu)自美國(guó)R&D公司。TRAP染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)

小鼠破骨細(xì)胞前體細(xì)胞系RAW264.7(四川大學(xué)華西醫(yī)院移植免疫實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送)用含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)分為無(wú)RANKL的α-MEM培養(yǎng)基組(α-MEM組)、無(wú)RANKL的DMEM高糖培養(yǎng)基組(DMEM組)、加入RANKL的α-MEM培養(yǎng)基組(RANKL+α-MEM組)、加入RANKL的DMEM高糖培養(yǎng)基組(RANKL+DMEM組)4組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，按1.5×104/cm2接種于6孔板或10 cm培養(yǎng)皿，分別用α-MEM或DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞增殖至90%后，向其中兩組加入RANKL，RANKL終濃度為50 ng/mL。于孵箱中培養(yǎng)72 h。

1.3 細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)記物檢測(cè)

1.3.1mRNA水平：采用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，取用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)為cDNA，通過(guò)qPCR分別檢測(cè)抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)、活化的T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T-cells 1，NFATc1)、核因子κB受體活化因子(receptor activator for nuclear factor-κB，RANK)以及組織蛋白酶(Cathepsin)K的mRNA表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 目的基因引物序列

1.3.2蛋白質(zhì)水平：分別檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞的TRAP、NFATc1和Cathepsin K蛋白表達(dá)水平。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，用RIPA(含1%PMSF)在冰上裂解細(xì)胞，收集裂解液在4 ℃、12 000 rpm離心20 min后取上清液，用BCA法定量總蛋白，各組取30 μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，用5%脫脂奶封閉，經(jīng)相應(yīng)一抗及二抗孵育，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.3.3細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶染色：RAW264.7細(xì)胞以1.5×104/cm2接種于玻片上，按上文實(shí)驗(yàn)方法分為4組，分別孵育72 h后，細(xì)胞用檸檬酸鹽/丙酮溶液固定30 s，在以萘酚 AS-BI磷酸鹽作為底物的混合液中避光孵育1 h(37 ℃)，去離子水清洗，干燥后甘油明膠封片，顯微鏡下見(jiàn)TRAP陽(yáng)性的多核細(xì)胞(細(xì)胞核≥3個(gè))即為破骨細(xì)胞，各組分別行破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 破骨細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)記物TRAP、NFATc1、RANK和Cathepsin K的mRNA表達(dá)水平

將破骨細(xì)胞前體細(xì)胞RAW264.7分別用加或不加RANKL的α-MEM、DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，通過(guò)qPCR分析TRAP、NFATc1、RANK以及Cathepsin K的mRNA表達(dá)水平(圖1)，加入RANKL后，DMEM組TRAP、Cathepsin K的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，NFATc1、RANK的表達(dá)減少，而α-MEM組的相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)水平均增加。

圖1 兩種培養(yǎng)基對(duì)RAW264.7細(xì)胞破骨分化相關(guān)標(biāo)記物mRNA表達(dá)水平的影響(*P<0.05)Fig.1 Effects of the two kinds of media on the mRNA expression levels of osteoclast related markers in RAW264.7 cells(*P<0.05)

2.2 破骨細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)記物蛋白表達(dá)水平

通過(guò)觀察蛋白電泳條帶(圖2)，結(jié)果顯示RANKL+α-MEM組較α-MEM組細(xì)胞分化相關(guān)蛋白表達(dá)水平增加，而RANKL+DMEM組與DMEM組間則未見(jiàn)明顯差異，這與qPCR的結(jié)果是基本一致的。

圖2 兩種培養(yǎng)基對(duì)RAW264.7細(xì)胞破骨分化相關(guān)標(biāo)記物蛋白表達(dá)水平的影響(*P<0.05)Fig.2 Effects of the two kinds of media on the protein expression levels of osteoclast related markers in RAW264.7 cells(*P<0.05)

圖3 兩種培養(yǎng)基對(duì)RAW264.7細(xì)胞分化為成熟破骨細(xì)胞的影響(*P<0.05)。A：TRAP染色圖片(×20)；B：TRAP染色分析結(jié)果(×20)Fig.3 Effects of the two kinds of culture media on the differentiation of RAW264.7 cells into mature osteoclasts. A: TRAP activity staining (×20); B: Numbers of TRAP-positive cells per field (×20).

2.3 細(xì)胞TRAP染色

成熟的破骨細(xì)胞為多核巨細(xì)胞，可見(jiàn)偽足樣胞漿突起，TRAP染色胞漿呈酒紅色顆粒。經(jīng)TRAP染色，當(dāng)未加入RANKL時(shí)，兩種培養(yǎng)基處理的細(xì)胞中均未見(jiàn)被染成酒紅色的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞。加入RANKL后，兩組細(xì)胞均可見(jiàn)TRAP陽(yáng)性細(xì)胞，其中RANKL+α-MEM組可見(jiàn)更多的分化更為成熟的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞(圖3)。

3 討論

RAW264.7細(xì)胞系是研究骨吸收過(guò)程的重要細(xì)胞模型，然而不同培養(yǎng)基對(duì)其細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)、老化等方面有著不同的影響，所以在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中選擇合適的培養(yǎng)基是十分必要的。本研究發(fā)現(xiàn)，在促分化的條件下，與DMEM高糖培養(yǎng)基相比，RAW264.7細(xì)胞在α-MEM培養(yǎng)基中表達(dá)的破骨細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)記物更多，形成的成熟破骨細(xì)胞更多，向破骨細(xì)胞分化的能力更強(qiáng)，這與劉水濤等[11]對(duì)人骨髓單個(gè)核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化研究的結(jié)果是一致的。

RANK/RANKL介導(dǎo)的信號(hào)通路是調(diào)控破骨細(xì)胞分化的重要通路。RANKL是成骨細(xì)胞表達(dá)的腫瘤壞死因子蛋白超家族成員之一[12]，與存在于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK結(jié)合后，可募集TRAFs激活下游信號(hào)，上調(diào)NFAT-c1的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[13]。Cathepsin K是破骨細(xì)胞功能性酶，在酸性條件下可參與降解I型膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)[14]。TRAP是破骨細(xì)胞的特異性標(biāo)志酶，可在酒石酸存在條件下將萘酚AS-BI磷酸鹽水解為萘酚AS-BI，與顯色劑結(jié)合形成紅色沉淀，光鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)紅色陽(yáng)性顆粒，用于輔助鑒定破骨細(xì)胞。故此，本研究選擇了TRAP、NFATc1、RANK以及Cathepsin K作為監(jiān)測(cè)破骨細(xì)胞分化的標(biāo)志，并行TRAP染色鑒定成熟的破骨細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，促破骨細(xì)胞分化條件下，用α-MEM培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)明顯升高，且成熟破骨細(xì)胞形成明顯，但DMEM高糖培養(yǎng)基中細(xì)胞的上述相關(guān)因子的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化或是有所降低，成熟破骨細(xì)胞形成不明顯。說(shuō)明各培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的成分及含量不同可能影響細(xì)胞的分化能力。

培養(yǎng)基的主要營(yíng)養(yǎng)成分包括葡萄糖、氨基酸、維生素和無(wú)機(jī)鹽。其中前3者在誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞分化的過(guò)程中具有十分重要的作用。誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化的最優(yōu)葡萄糖濃度為5 mmol/L，與α-MEM培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度相當(dāng)(約為5.5 mmol/L)，而當(dāng)環(huán)境中葡萄糖濃度升至20 mmol/L時(shí)(DMEM高糖培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為25 mmol/L)，細(xì)胞的分化效應(yīng)則減弱[15]。這可能是由于高糖條件下肝X受體β可被激活，從而抑制破骨細(xì)胞的分化[16]。不同培養(yǎng)基中的氨基酸組成及含量也不相同，甘氨酸、谷氨酸、芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)在各種培養(yǎng)基中普遍存在，其中芳香族氨基酸在DMEM高糖培養(yǎng)基中的含量(186 mg/L)高于α-MEM培養(yǎng)基(94 mg/L)。芳香族氨基酸具有抗氧化活性，可參與抑制破骨細(xì)胞貼壁及分化、減少骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的氧化損傷[17]。Refaey等[18]報(bào)道芳香族氨基酸可減少破骨細(xì)胞分化相關(guān)分子的表達(dá)，抑制成熟破骨細(xì)胞形成，減少骨丟失。因此含有較少芳香族氨基酸成分的α-MEM培養(yǎng)基更能促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞分化。

目前發(fā)現(xiàn)維生素家族中的維生素C和維生素B12可能參與骨代謝，其在α-MEM培養(yǎng)基中的含量分別為50 mg/L和1.36 mg/L，而DMEM培養(yǎng)基則不含有此兩種物質(zhì)。上述兩種維生素的缺乏可能與促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、自發(fā)性骨折相關(guān)[19-22]。但本實(shí)驗(yàn)中未含有這兩種維生素的DMEM高糖培養(yǎng)基對(duì)破骨細(xì)胞原始細(xì)胞的促分化能力較弱，說(shuō)明α-MEM與DMEM高糖培養(yǎng)基中其他成分的差異也可能對(duì)骨代謝存在影響。

相對(duì)高濃度的葡萄糖和芳香族氨基酸可能是本實(shí)驗(yàn)中DMEM高糖培養(yǎng)基促RAW264.7細(xì)胞分化效應(yīng)較差、甚至可能抑制部分細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的主要原因。與之相比，α-MEM培養(yǎng)基中葡萄糖和芳香族氨基酸含量則更為適宜。本研究表明，在探究RAW264.7細(xì)胞的性質(zhì)及分化效能時(shí)，α-MEM是較為理想的促分化培養(yǎng)基。