許閆嚴(yán) 張克良 魏忠民 沈波

武漢市第四醫(yī)院 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院西院骨一科，湖北 武漢 430000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種與年齡、性別、環(huán)境、遺傳等相關(guān)的退行性疾病。女性絕經(jīng)后患骨質(zhì)疏松癥的概率要遠(yuǎn)大于男性，主要是由于雌激素缺乏所導(dǎo)致[1]。雌激素的缺乏將導(dǎo)致患者骨代謝紊亂、破骨細(xì)胞分化因子增加、未成熟的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)增多及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞減少，這些變化最終導(dǎo)致骨吸收與骨生成平衡被打破，造成骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨量減少、骨強(qiáng)度下降，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[2-4]，據(jù)此越來(lái)越多的學(xué)者通過摘除卵巢的方法來(lái)制備骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型[5-6]。在臨床研究中，對(duì)雌激素治療絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的研究大多僅限于臨床療效的觀察上。例如，黎濤等[7]使用雌激素聯(lián)合抗骨質(zhì)疏松藥物治療絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥具有顯著的臨床療效。而相關(guān)作用機(jī)制研究鮮有報(bào)道，尤其是骨密度(bone mineral density，BMD)和骨代謝方面。因此，筆者于2015年9月至2016年3月利用去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型的大鼠進(jìn)行研究，旨在通過補(bǔ)充雌激素的刺激作用，觀察其對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨密度和骨代謝的影響，探討雌激素治療絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組與造模

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理?xiàng)l例。選用雌性健康的SD大鼠48只，鼠齡5～6個(gè)月，體重(245±24)g，未曾交配，購(gòu)自于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將SD大鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組(12只)、模型組(12只)、雌激素組(12只)和雌激素+三苯氧胺組(12只)。對(duì)照組，即假手術(shù)組，在手術(shù)過程中只暴露卵巢而不切除，隨后立即進(jìn)行縫合處理；其他各組大鼠采用雙側(cè)卵巢摘除法制備骨質(zhì)疏松癥模型。手術(shù)方法：使用3%戊巴比妥(注射量按大鼠體質(zhì)量計(jì)算)腹腔注射麻醉處理，沿背部正中左右兩側(cè)軟肋下剪開皮膚，切口長(zhǎng)約2.0 cm，向一側(cè)分離皮膚筋膜及腹膜臟層，暴露腹腔，找到子宮后確認(rèn)雙側(cè)卵巢。對(duì)照組保留雙側(cè)卵巢，其他各組大鼠進(jìn)行結(jié)扎及摘除兩側(cè)整個(gè)卵巢組織，分層縫合后，外層皮膚消毒。手術(shù)過程中無(wú)大鼠死亡，術(shù)后所有大鼠均臀部肌肉注射青霉素(200萬(wàn)U/kg)預(yù)防術(shù)后感染，注射3 d，每日1次，手術(shù)后自由攝食和攝水。

1.2 給藥及取材

手術(shù)一個(gè)月后開始給藥。雌激素組給予尼爾雌醇(北京四環(huán)制藥有限公司)灌胃(按體質(zhì)量計(jì))，用藥劑量[8]為1 mg/kg，生理鹽水配制，1次/w；雌激素+三苯氧胺組給予尼爾雌醇(1 mg/kg)和三苯氧胺(山東健康藥業(yè)有限公司，用藥劑量[9]為3 mg/kg)灌胃，生理鹽水配制，1次/w；對(duì)照組和模型組分別使用等量生理鹽水灌胃。持續(xù)3個(gè)月，每周稱量體重1次，并按照體重變化調(diào)整給藥量。給藥前每組隨機(jī)采用10%水合氯醛(3 mL/kg)注射麻醉6只大鼠，分別取血及剝離脛骨及股骨組織保存。給藥3個(gè)月后，對(duì)剩下所有大鼠(每組6只)進(jìn)行一次眼球取血3～5 mL，-20 ℃保存。取血后，10%水合氯醛注射麻醉(3 mL/kg)，在無(wú)菌條件下取大鼠右后肢脛骨及股骨干骺端，剝離附著的肌肉及解體組織，充分暴露股骨頭，用消毒后的老虎鉗將脛骨、股骨頭鉗碎，分別放入無(wú)菌的EP管中，-80 ℃保存。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1血清生化指標(biāo)的測(cè)定：取血液3 mL，3 000 r/min 離心15 min，取血清。采用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定血清鈣含量；采用酶聯(lián)免疫法測(cè)血清總堿性磷酸酶(alkaline phosphates，ALP)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRAP-5b)的含量，ALP及TRAP檢測(cè)試劑盒均由上海生工提供。

1.3.2骨骼鈣的測(cè)定：取右后腿脛骨并剝離附著在脛骨上面的肌肉及解體組織，將骨頭置于90 ℃烘箱中烘5～6 h后，碾碎并稱其質(zhì)量(約1 g)，緩慢將碾碎的脛骨置于刻度均一的離心管中，加入8 mL硝酸，放置于搖床(低速)上過夜，將95 ℃水浴鍋中加熱至溶液清澈透明，用超純水定容至50 mL。取樣品1 mL稀釋1 000倍，測(cè)定骨骼中鈣的含量。

1.3.3骨礦物鹽含量的測(cè)定：將大鼠股骨放入烤箱，105 ℃烤干至恒重后稱量為干重，烤干后的樣品放入灰化爐650 ℃灰化 36 h，取出稱量為灰分重量，礦鹽含量為灰分重量與干重之比。

1.3.4骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)蛋白表達(dá)的檢測(cè)：將大鼠左側(cè)脛骨組織進(jìn)行常規(guī)脫鈣，包埋、切片、脫蠟、用雙氧水滅活內(nèi)源性酶，進(jìn)行高溫高壓修復(fù)3 min，山羊血清封閉液室溫封閉1 h，滴加OPG(CST，1∶100)及RANKL(CST，1∶100)一抗孵育過夜，滴加生物素二抗室溫孵育2 h，滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物試劑，二氨基聯(lián)苯胺顯色后，蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。細(xì)胞胞漿著色呈現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定著色部位的平均光密度值，作為OPG及RANKL蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。

1.3.5骨密度的測(cè)定：使用美國(guó)GE公司生產(chǎn)的LunarDPX-Prodigy雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x測(cè)定大鼠左側(cè)股骨的骨密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清鈣及骨骼鈣含量的檢測(cè)結(jié)果

給藥前與對(duì)照組比較，模型組、雌激素組和雌激素+三苯氧胺組血鈣含量顯著升高(P<0.05)，骨鈣含量顯著降低(P<0.05)。給藥治療后與給藥前比較，雌激素組血鈣含量顯著降低(P<0.05)，骨鈣含量顯著上升(P<0.05)，模型組和雌激素+三苯氧胺組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥后與模型組比較，雌激素組血鈣含量顯著降低(P<0.05)，骨鈣含量顯著上升(P<0.05)，而雌激素+三苯氧胺組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血清鈣、骨骼鈣給藥前后含量比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組相比，◆P<0.05；給藥后與給藥前相比較，▲P<0.05。

2.2 大鼠骨代謝相關(guān)生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果

給藥前與對(duì)照組比較，模型組、雌激素組和雌激素+三苯氧胺組血清ALP含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，血清TRAP-5b含量顯著升高(P<0.05)。給藥治療后與給藥前比較，雌激素組血清ALP含量顯著升高(P<0.05)，TRAP-5b含量顯著降低(P<0.05)，模型組和雌激素+三苯氧胺組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥后與模型組比較，雌激素組血清ALP含量顯著升高(P<0.05)，TRAP-5b含量顯著降低(P<0.05)，雌激素+三苯氧胺組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠給藥前后骨代謝生化指標(biāo)比較

注：與對(duì)照組相比較，*P<0.05；與模型組相比，◆P<0.05；給藥后與給藥前相比較，▲P<0.05。

2.3 各組大鼠股骨骨密度及骨礦物鹽含量的檢測(cè)結(jié)果

給藥前與對(duì)照組比較，模型組、雌激素組和雌激素+三苯氧胺組BMD和骨礦物鹽含量顯著降低(P<0.05)。給藥后與給藥前比較，雌激素組BMD和骨礦物鹽含量顯著升高(P<0.05)，模型組BMD和骨礦物鹽含量則繼續(xù)顯著降低(P<0.05)，雌激素+三苯氧胺組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后與模型組比較，雌激素組BMD和骨礦物鹽含量顯著升高(P<0.05)，雌激素+三苯氧胺組BMD和骨礦物鹽含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠給藥前后左側(cè)股骨BMD值和骨礦物鹽含量比較

注：與對(duì)照組相比較，*P<0.05；與模型組相比，◆P<0.05；給藥后與給藥前相比較，▲P<0.05。

2.4 大鼠脛骨中OPG和RANKL蛋白表達(dá)測(cè)定

與對(duì)照組比較，模型組和雌激素+三苯氧胺組OPG蛋白顯著下調(diào)(P<0.05)，RANKL蛋白顯著升高(P<0.05)；雌激素組OPG蛋白和RANKL蛋白則無(wú)顯著性變化。與模型組比較，雌激素組OPG蛋白顯著升高(P<0.05)，RANKL蛋白顯著降低(P<0.05)；而雌激素+三苯氧胺組OPG蛋白和RANKL蛋白則無(wú)顯著性變化(P>0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠脛骨OPG和RANKL蛋白表達(dá)平均光密度值比較Table 4 Comparison of the mean optical density of OPG and RANKL protein expression between

注：與對(duì)照組相比較，*P<0.05；與模型組相比，◆P<0.05。

3 討論

去卵巢后大鼠所引起的生理學(xué)上的變化與絕經(jīng)后婦女相似，而這一變化主要是由于體內(nèi)雌激素缺乏所致。有研究表明，當(dāng)雌激素缺乏時(shí)會(huì)引起骨中鈣的結(jié)合能力減弱，導(dǎo)致破骨細(xì)胞的吸收作用增強(qiáng)，骨質(zhì)丟失速度加快，引起骨量減少[10]，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，而這些也是導(dǎo)致絕經(jīng)后女性人群骨質(zhì)疏松癥高發(fā)的一個(gè)重要原因。據(jù)2009年一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[11]，絕經(jīng)后女性發(fā)生骨質(zhì)疏松的概率為9.4%～37.9%，遠(yuǎn)高于絕經(jīng)前女性的1.8%～3.2%。通過補(bǔ)充雌激素治療絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥或許是一個(gè)潛在的治療方法，早在1972年Aitken等[12]就在動(dòng)物模型中嘗試使用雌激素治療骨質(zhì)疏松癥，發(fā)現(xiàn)雌激素能夠促進(jìn)新骨的形成?，F(xiàn)如今，雌激素類藥物在骨質(zhì)疏松的治療中被廣泛運(yùn)用，并具有一定的療效。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是因雌激素匱乏導(dǎo)致骨重建失衡引起的高轉(zhuǎn)換型代謝性骨疾病。有研究表明[13]，雌激素缺乏可導(dǎo)致成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的比例失衡，骨吸收作用增強(qiáng)，骨形成減少，最終導(dǎo)致骨量丟失。本研究的結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥模型大鼠血鈣含量明顯增加，骨鈣含量顯著減少。經(jīng)過雌激素治療后，大鼠血鈣含量則顯著降低，骨鈣含量明顯增加，而采用雌激素受體拮抗劑三苯氧胺與雌激素灌胃治療并未顯著降低血鈣含量和顯著增加骨鈣含量。且治療后雌激素組大鼠與骨吸收相關(guān)標(biāo)志物TRAP-5b水平顯著低于模型組，骨形成標(biāo)志物ALP則顯著高于模型組，而雌激素+三苯氧胺組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明雌激素治療可以通過阻止去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨骼鈣的流失，從而促進(jìn)骨形成。治療后與治療前比較，模型組中ALP水平也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，根據(jù)骨代謝中骨吸收增加與骨形成動(dòng)態(tài)平衡原理，可能是由于骨吸收的增強(qiáng)而導(dǎo)致的代償性骨形成增加所致[14]。另外，骨密度和骨礦物鹽含量的檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組大鼠的股骨骨密度和骨礦物質(zhì)鹽含量顯著低于對(duì)照組，而雌激素治療后，能夠顯著提高大鼠股骨骨密度和骨礦物質(zhì)鹽含量，但雌激素+三苯氧胺組則未顯著提高大鼠股骨骨密度和骨礦物質(zhì)鹽含量。說(shuō)明雌激素對(duì)提高骨密度和防止骨礦物鹽流失具有極大的促進(jìn)作用。

OPG/RANKL/RANK信號(hào)系統(tǒng)是破骨細(xì)胞分化成熟過程中的調(diào)控樞紐和關(guān)鍵的信號(hào)途徑[15]，RANK和RANKL結(jié)合可導(dǎo)致破骨細(xì)胞前體分化和成熟，而OPG能夠和RANK競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合RANKL，間接地降低破骨細(xì)胞的活性和分化，在骨量調(diào)節(jié)中起著重要的作用[16-17]。本研究結(jié)果顯示雌激素組大鼠骨中OPG蛋白表達(dá)量要高于模型組，而RANKL蛋白表達(dá)量則低于模型組，而雌激素+三苯氧胺組與模型組比較，OPG和RANKL蛋白表達(dá)無(wú)顯著性變化。這充分說(shuō)明雌激素能夠提高OPG蛋白表達(dá)，有利于與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，降低破骨細(xì)胞的活性和分化，對(duì)抑制骨質(zhì)疏松的形成起著重要作用。

本研究充分說(shuō)明雌激素可以通過提高骨密度及骨礦物含量，降低骨轉(zhuǎn)化，對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥的治療具有明顯的療效。但本研究還存在不足之處，例如本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象僅為雌性去勢(shì)SD大鼠，存在一定的局限性；且有研究表明長(zhǎng)期應(yīng)用雌激素會(huì)對(duì)子宮等骨骼外的器官造成不良影響，可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌等生殖系統(tǒng)癌癥[18]，使雌激素在骨質(zhì)疏松癥的治療上蒙上了一層陰影。因此，為了讓雌激素更好地應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療，還需要更多的探索。