李文苑 葸慧榮 高玉海 楊芳芳 陳克明

蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，甘肅 蘭州 730050

航天飛行是人類(lèi)遇到的最極端的情況之一，宇航員在地球軌道以外的任務(wù)將需要長(zhǎng)時(shí)間在微重力環(huán)境下生活和工作。據(jù)報(bào)道，每位宇航員在太空中損失大約1%的骨密度(bone mineral density，BMD)，這表明宇航員在任務(wù)期間或之后可能處于較高的骨折風(fēng)險(xiǎn)。更好地了解由這些因素引起的問(wèn)題，可以最大限度地降低宇航員骨量丟失，提高骨質(zhì)量從而幫助宇航員空間飛行順利[1-4]。

目前，骨質(zhì)疏松的治療方法主要以藥物為主，但由于抗骨質(zhì)疏松癥藥物的副作用及高成本[5-7]，安全無(wú)創(chuàng)生物物理刺激對(duì)預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥更有前景。據(jù)報(bào)道，正弦交變電磁(sinusoidal electromagnetic fields，SEMFs)能夠防止大鼠尾吊(hind-limb suspension，HLS)模型中模擬微重力引起的骨丟失[8]。地面上模擬空間微重力導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥最受認(rèn)可的動(dòng)物模型之一是后肢懸吊模型。大鼠的尾吊模型可模擬在太空飛行期間生長(zhǎng)的大鼠中的骨轉(zhuǎn)換和肌肉變化[9-10]，尾吊模型大大提高了微重力疾病研究的效率。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，50 Hz 1.8 mT SEMFs可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化及礦化成熟[11]。因此，本研究選用大鼠尾吊模型模擬空間微重力環(huán)境，探究50 Hz 1.8 mT正弦交變電磁場(chǎng)是否能抑制尾吊所致大鼠的骨量丟失，從而為電磁場(chǎng)治療骨質(zhì)疏松癥的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

雙能X線骨密度儀(GE公司，美國(guó))，BX53型正置顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)，AG-X系列臺(tái)式電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(島津公司，日本)，酶標(biāo)儀(BioTeK公司，美國(guó))，高分辨率活體顯微CT(Micro-CT SkyScan1176，比利時(shí)Bruker micro CT 公司)，SP1600硬組織切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。水合氯醛(天津大茂化學(xué)試劑公司，中國(guó))，血清骨鈣素(osteocalcin，OC)試劑盒(上海研吉公司，中國(guó))，抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b，TRACP-5b)試劑盒(IDS Itd公司，英國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

6周齡SPF級(jí)SD雌性大鼠30只，體重(180±10)g，由甘肅省蘭州市獸醫(yī)研究所提供 [許可證號(hào)：SCXK(2015-0001)]，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先訓(xùn)養(yǎng)大鼠1 w，按照體重隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為對(duì)照組、HLS組和HLS+SEMFs組。HLS+SEMFs組大鼠采用50 Hz 1.8 mT正弦交變電磁場(chǎng)每天干預(yù)1.5 h，期間大鼠仍然保持后肢懸空。大鼠飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，濕度50%～70%。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)水進(jìn)食，每周監(jiān)測(cè)一次大鼠體重。

1.3 雙能X射線骨密度儀檢測(cè)大鼠骨密度

尾吊大鼠在50 Hz 1.8 mT 正弦電磁場(chǎng)下治療4 w后，處死全部大鼠，剝離主要器官固定于10%甲醛溶液中。剝離股骨、脛骨和椎骨，用0.9%NaCl浸泡過(guò)的紗布包裹，于-20 ℃保存。檢測(cè)前將凍存于-20 ℃冰箱中的椎骨和股骨在室溫下自發(fā)解凍。通過(guò)雙能X射線吸收測(cè)定法檢測(cè)股骨和椎骨的BMD。

1.4 生物力學(xué)檢測(cè)

椎骨和右側(cè)股骨用浸透了0.9%NaCl溶液的紗布包裹后置于-80 ℃凍存，臨用前自然解凍。股骨置于AG-IS型萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行三點(diǎn)彎曲測(cè)試，跨距14 mm，加載速度10 mm/min，計(jì)算機(jī)記錄載荷變形曲線及最大載荷、彈性模量等。取大鼠第4腰椎骨(L4)用于壓縮實(shí)驗(yàn)，將椎體兩面的椎間盤(pán)及軟組織切除，用砂紙將椎骨打磨成上下兩個(gè)面平行的圓柱體，將圓柱體垂直放置于不銹鋼平臺(tái)上，逐漸加載壓力，加載速度為2 mm/min，記錄載荷變形曲線，獲得最大載荷、彈性模量等。

1.5 血清生化指標(biāo)分析

大鼠麻醉后自腹主動(dòng)脈抽取血樣，靜置10 min，5000 r/min離心10 min，取上層血清凍存于-80 ℃中。骨形成指標(biāo)檢測(cè)OC，骨吸收指標(biāo)檢測(cè)TRACP-5b，均采用丹麥IDS公司生產(chǎn)的試劑盒。按說(shuō)明書(shū)制作各自標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中OC和TRACP-5b的含量，單位分別為ng/mL和U/L。

1.6 Micro-CT分析

將大鼠股骨用顯微CT成像后分析，分析區(qū)域選在骨骺線下方5 mm處。用顯微CT軟件對(duì)所選區(qū)域進(jìn)行三維重建，得出三維重建效果圖及股骨最大縱剖面圖。同時(shí)對(duì)股骨松質(zhì)骨的骨微結(jié)構(gòu)進(jìn)行骨形態(tài)參數(shù)分析，包括BMD、骨表面積比體積(bone surface/ volume，BS/BV)、松質(zhì)骨體積(bone/tissue volume，BV/TV)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)和骨小梁離散程度(trabecular separation，Tb.Sp)。

1.7 骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)分析

圖2 各組大鼠離體骨密度。A：股骨離體骨密度；B：椎骨離體骨密度Fig.2 Bone mineral density of rats in each group. A：Bone mineral density of the femur；B：Bone mineral density of vertebrae

采用不脫鈣骨組織切片法進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析[11]。新鮮分離的左側(cè)股骨用4%多聚甲醛固定后，梯度濃度乙醇脫水，過(guò)渡至二甲苯中，隨后浸入以40%甲基丙烯酸甲酯、10%鄰苯二甲酸二丁酯和50%二甲苯配成的1號(hào)液，80%甲基丙烯酸甲酯、20%鄰苯二甲酸二丁酯配成的2號(hào)液，80%甲基丙烯酸甲酯、20%鄰苯二甲酸二丁酯和20 g過(guò)氧化苯甲酰配成的3號(hào)液中各7 d，最后用80%甲基丙烯酸甲酯、20%鄰苯二甲酸二丁酯和60 g過(guò)氧化苯甲酰配成的4號(hào)液包埋。將包埋好的骨組織用LEICA SP1600鋸式切片機(jī)切成約50 μm的骨片，用502膠水將骨片封固于載玻片上，用1200～2000目砂紙打磨至顯微鏡下可見(jiàn)的厚度，然后用Van Gilson方法(VG染色)染色。簡(jiǎn)言之，60 ℃亞甲藍(lán)染色5～8 min，洗滌不褪色，苦味酸品紅染色15 min，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色切片，成像靜態(tài)組織形態(tài)計(jì)量分析。使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th。

1.8 臟器系數(shù)分析

大鼠處死后，分離心臟、肝臟、腎臟和肺臟等器官，并將其周?chē)闹窘M織剝離，稱(chēng)量每個(gè)器官的重量。計(jì)算器官指數(shù)(器官指數(shù)=器官重量/大鼠體重×100%)，用10%甲醛溶液固定內(nèi)臟。將器官石蠟包埋切片，HE染色進(jìn)行毒理學(xué)分析，評(píng)價(jià)電磁場(chǎng)的副作用。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法。每個(gè)變量用3組進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重變化結(jié)果

如圖1所示，與正常對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組大鼠體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明尾吊以及磁場(chǎng)干預(yù)對(duì)大鼠體質(zhì)量沒(méi)有明顯的影響。

圖1 各組大鼠體重Fig.1 The body weight of each group

2.2 大鼠離體骨密度檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，HLS組股骨和椎骨骨密度顯著下降(P<0.01，P<0.01)，與HLS組相比，治療組股骨和椎骨骨密度顯著升高(P<0.05，P<0.01)，說(shuō)明尾吊后大鼠的骨密度明顯下降，而1.5 h正弦電磁場(chǎng)治療對(duì)尾吊大鼠骨密度有一定提高。見(jiàn)圖2。

2.3 大鼠股骨三點(diǎn)彎曲和椎骨壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與對(duì)照組相比，HLS組股骨和椎體的最大載荷和彈性模量值均顯著降低(P<0.01)；與HLS相比，HLS+SEMFs組股骨最大載荷值顯著升高(P<0.05)，而彈性模量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與HLS相比，HLS+SEMFs組椎骨彈性模量值顯著升高(P<0.05)，而最大載荷值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠股骨三點(diǎn)彎曲和椎骨壓縮實(shí)驗(yàn)。A：股骨彈性模量；B：股骨最大載荷值；C：椎骨彈性模量；D：椎骨最大載荷值Fig.3 Three-point femoral flexion and vertebral compression experiment. A: Modulus of elasticity of femur; B: Maximum load value of femur; C: Elastic modulus of vertebra; D: Maximum load value of vertebra

2.4 大鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果

圖4 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較。A：血清OC含量；B：血清TRACP-5b含量Fig.4 Serum biochemical markers in rats. A：The content of osteocalcin in serum；B：The content of tartrate-resistant acid phosphatase 5b in serum

HLS組和治療組血清OC(骨形成指標(biāo))相比于對(duì)照組顯著降低(P<0.01，P<0.05)，HLS+SEMFs 組OC值相比于HLS組顯著上升(P<0.01)；HLS組血清TRACP-5b濃度相比于對(duì)照組明顯升高(P<0.01)；與HLS組相比，HLS+SEMFs組TRACP-5b值明顯下降(P<0.01)，說(shuō)明磁場(chǎng)的干預(yù)對(duì)提高大鼠OC水平和降低TRACP-5b水平均有一定影響。見(jiàn)圖4。

2.5 大鼠Micro-CT分析結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的顯微CT圖像如圖5所示，與對(duì)照組相比，HLS大鼠的股骨顯示骨小梁數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁面積顯著降低，分離度升高。SEMFs部分抑制小梁骨微結(jié)構(gòu)的減少，相比HLS組骨小梁數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁面積顯著升高，且分離度下降。如圖5B～5G所示，HLS導(dǎo)致骨小梁BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th(P<0.01)顯著降低，BS/BV、Tb.Sp(P<0.01)明顯升高。SEMFs治療明顯提高松質(zhì)骨BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th(P<0.01，P<0.05)，BS/BV、Tb.Sp則降低(P<0.01，P<0.05)。此外，對(duì)照組與HLS+SEMFs組相比BMD明顯升高(P<0.01)。50 Hz 1.8 mT正弦電磁場(chǎng)對(duì)大鼠松質(zhì)骨BMD有明顯促進(jìn)作用。

2.6 大鼠VG染色結(jié)果

圖5 各組大鼠Micro-CT分析Fig.5 Micro-CT analysis of rats in each group

圖6 各組大鼠VG染色及其結(jié)果Fig.6 Rat VG staining

4 w HLS大鼠正弦電磁場(chǎng)照射后，如圖6 A中VG染色顯示，HLS組與對(duì)照組相比，骨小梁數(shù)量和厚度明顯降低，分離度升高，SEMFs治療與HLS組相比，骨小梁數(shù)量和厚度增加，分離程度降低。定量結(jié)果顯示，對(duì)照組和HLS組之間骨小梁數(shù)目、骨小梁骨厚度和骨小梁分離度情況差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。SEMFs治療后與對(duì)照組相比，骨小梁數(shù)量和厚度增加(P<0.01，P<0.05)，分離程度降低(P<0.05)。

2.7 各組大鼠臟器病理學(xué)分析結(jié)果

HLS組大鼠和正弦治療組大鼠相比于對(duì)照組，臟器系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，病理分析無(wú)異常，器官指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明電磁場(chǎng)干預(yù)無(wú)毒副作用，見(jiàn)圖7。

3 討論

宇航員在空間飛行中骨密度明顯降低，已被證明會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[12]。骨質(zhì)疏松作為一種威脅人類(lèi)健康的疾病，如何有效地治療及預(yù)防就變得至關(guān)重要。物理電磁法作為一種常用的治療方法，已被廣泛應(yīng)用于臨床治療各種骨創(chuàng)傷。據(jù)報(bào)道，電磁場(chǎng)能夠在動(dòng)物模型中改善尾吊引起的骨質(zhì)疏松癥[8]，但是具體的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究采用大鼠進(jìn)行尾吊，這種模型已被證明可以有效地造成大鼠骨質(zhì)疏松。與失去正常負(fù)重活動(dòng)或長(zhǎng)期臥床的人類(lèi)有相似之處的是，大鼠尾吊之后會(huì)破壞骨代謝的平衡，進(jìn)而導(dǎo)致骨小梁丟失[13-14]，從而增加骨折風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)參考Zhou等[11]在細(xì)胞水平篩選出的最佳正弦交變電磁場(chǎng)參數(shù)(50 Hz 1.8 mT)對(duì)尾吊大鼠進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)對(duì)尾吊大鼠BMD、生物力學(xué)、血清生化、Micro-CT和骨組織形態(tài)學(xué)的研究，探討其作用機(jī)制，為臨床治療失重引起的骨質(zhì)疏松的病理以及磁場(chǎng)治療機(jī)制提供有力幫助。

實(shí)驗(yàn)期間，每周稱(chēng)量大鼠的體重，大鼠體重趨勢(shì)反映了大鼠在飼養(yǎng)過(guò)程中的狀況，本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組大鼠體重均呈上升趨勢(shì)，各組間大鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，生長(zhǎng)狀況穩(wěn)定。BMD作為評(píng)價(jià)骨強(qiáng)度的指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)股骨和椎骨離體骨密度能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)骨折發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[15-16]，尾吊4 w后，與對(duì)照組大鼠相比，通過(guò)檢測(cè)可觀察到HLS組大鼠BMD顯著降低；與HLS組大鼠相比，SEMFs治療組的大鼠的BMD顯著增加。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SEMFs可以增加BMD，如股骨和椎骨的BMD。因此，1.5 h 50 Hz 1.8 mT的正弦電磁場(chǎng)可顯著提高大鼠的骨密度。骨的生物力學(xué)直接反映骨自身強(qiáng)度和韌性，它與骨骼中各種礦質(zhì)含量和骨密度有關(guān)。電磁場(chǎng)可以顯著影響股骨和椎骨的骨密度，與此同時(shí)，它對(duì)于大鼠生物力學(xué)也會(huì)有一定影響。骨質(zhì)疏松治療研究中常用的生物力學(xué)指標(biāo)主要是最大載荷值和彈性模量，它們直觀反映大鼠骨骼整體的抗骨折能力。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)股骨和椎骨的生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SEMFs可以顯著增加骨骼的機(jī)械強(qiáng)度，抑制骨外在結(jié)構(gòu)的惡化。經(jīng)過(guò)課題組研究表明，SEMFs刺激能夠降低HLS大鼠松質(zhì)骨的機(jī)械強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)的惡化，從而改善大鼠骨骼的整體生物力學(xué)性能。

骨骼能夠保持其正常結(jié)構(gòu)和功能完整性，是由于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡。生化指標(biāo)體現(xiàn)體內(nèi)的骨代謝水平，客觀地反映大鼠的骨吸收和骨形成。長(zhǎng)期尾吊干擾大鼠骨代謝的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致骨形成減少和骨吸收增加[17-18]。實(shí)驗(yàn)表明1.5 h 50 Hz 1.8 mT SEMFs干預(yù)可以顯著促進(jìn)HLS組大鼠血清OC的分泌，對(duì)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用。4 w尾吊導(dǎo)致骨吸收的血清標(biāo)志物TRACP-5b顯著增加，SEMFs治療后對(duì)血清中TRACP-5b濃度有適度的抑制作用。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SEMFs具有一定提高成骨細(xì)胞形成和抑制破骨細(xì)胞形成的調(diào)節(jié)作用。

Micro-CT常用于骨小梁的研究，可以直觀地觀察大鼠松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)的變化。在大鼠股骨的Micro-CT觀察中，發(fā)現(xiàn)HLS大鼠骨小梁骨架結(jié)構(gòu)明顯惡化，HLS導(dǎo)致骨小梁BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th降低，但是BS/BV、Tb.Sp明顯升高。SEMFs干預(yù)4 w后能夠顯著抑制骨小梁微結(jié)構(gòu)的惡化，提高骨質(zhì)量。課題組的研究結(jié)果表明，SEMFs可以通過(guò)促進(jìn)骨形成，部分治療尾吊大鼠的骨質(zhì)量減少和骨微結(jié)構(gòu)的惡化。

骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)是對(duì)骨微結(jié)構(gòu)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，反映了機(jī)體組織形態(tài)學(xué)的變化。通過(guò)觀察SEMFs治療組與HLS組VG染色結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)骨小梁數(shù)量和厚度增加，分離程度低。組織形態(tài)學(xué)計(jì)量結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了SEMFs在骨重塑中的調(diào)節(jié)作用，具有明顯的合成代謝和適度的抗再吸收作用。臟器系數(shù)是用來(lái)評(píng)價(jià)電磁場(chǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠副作用的指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)中各組臟器系數(shù)相比于對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病理學(xué)分析并無(wú)異常，說(shuō)明電磁場(chǎng)對(duì)大鼠無(wú)毒性影響。

綜上所述，與對(duì)照組相比，4 w后各組大鼠體重均有增加，生長(zhǎng)正常。治療組大鼠與對(duì)照組大鼠相比，通過(guò)骨密度、生物力學(xué)、血清生化檢測(cè)、Micro-CT和組織形態(tài)測(cè)定結(jié)果證明，50 Hz 1.8 mT正弦電磁場(chǎng)照射1.5 h可以促進(jìn)尾吊大鼠的骨骼合成代謝活動(dòng)，部分提高尾吊大鼠的骨質(zhì)量、骨微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)強(qiáng)度。本課題組的實(shí)驗(yàn)更加明確地證明了SEMFs作為一種安全高效的骨質(zhì)疏松癥治療方式，可以用于空間飛行中宇航員骨量丟失的臨床治療。